Un ‘interruttore genetico’ in grado di rendere ancora più “feroce” il Lupus, la malattia autoimmune che colpisce soprattutto il sesso femminile. A scoprirlo i ricercatori della facoltà di Medicina della Cattolica di Roma. Un risultato che – secondo quanto spiegato Gianfranco Ferraccioli, docente di Reumatologia e responsabile dell’Unità Operativa di Reumatologia e Medicina Interna CIC del Policlinico Gemelli – potrebbe condurre a nuove terapie più mirate ed efficaci contro questa complessa malattia, in particolare contro i casi più gravi e meno gestibili.
L’'interruttore' scoperto si chiama “enhancer HS1.2", agisce come il pedale di accelerazione dell’automobile e iperattiva una serie di geni che amplificano la risposta immunitaria patologica tipica della malattia. Il risultato finale è che le cellule immunitarie impazzite che producono gli anticorpi patologici, attaccano il corpo del paziente invece di difenderlo (autoanticorpi).
Lo studio che Ferraccioli ha realizzato insieme a Domenico Frezza della facoltà di Biologia dell’Università di Roma Tor Vergata e a Raffaella Scorza dell’Università Statale di Milano è stato recentemente pubblicato sulla rivista Annals of the Rheumatic Diseases.
Il Lupus eritematoso sistemico è una malattia autoimmune, cioè una patologia in cui il sistema immunitario del paziente va “in tilt” e comincia ad attaccare il corpo del paziente stesso, invece di difenderlo. È una malattia feroce come l’animale, il lupo, da cui prende il nome, per le caratteristiche chiazze rossastre (simili alle macchie sul pelo del lupo) che compaiono sul viso dei pazienti. Il Lupus colpisce in Italia circa 60.000 persone e la fascia di età più a rischio è quella tra i 15 e i 45 anni, con una netta preferenza per il sesso femminile. Si tratta di una malattia dai tanti volti perché colpisce diversi organi e tessuti e dà una molteplicità di sintomi che ne rendono anche difficile la diagnosi, tra cui dolori alle articolazioni, febbre, manifestazioni cutanee, perdita di capelli, raynaud, anemia, nefrite, cerebrite.
Le terapie oggi in uso contro il Lupus, ha spiegato Ferraccioli, si basano sull’uso oculato del cortisone, di farmaci antimalarici e immunosoppressori (azatioprina, micofenolato, ciclofosfamide) e negli ultimi anni anche di farmaci biologici (Rituximab, Belimumab). Ma ci sono parecchi casi in cui il Lupus si manifesta in modo più aggressivo e finora non era chiara l’origine di questa particolare gravità.
I ricercatori italiani hanno scoperto che il succo del problema risiede nell’interruttore di accelerazione enhancer HS1.2. In generale gli enhancer, potenziatori genetici, sono delle sequenze di dna deputate ad accelerare l'attivazione di geni limitrofi, da cui il nome. HS1.2 porta a un’attivazione potenziata del “fattore di trascrizione Nf-KB” (un fattore di trascrizione è una molecola che “legge” i geni per farli funzionare) che a sua volta aumenta enormemente l’aggressività dei processi infiammatori alla base della malattia.
In particolare, gli studiosi della Cattolica di Roma hanno scoperto che oltre il 30% del totale dei pazienti è portatore sul proprio Dna dell'enhancer HS1.2 e che questo causa una forma più grave di Lupus. Si è potuti giungere a questa scoperta dopo aver dimostrato negli ultimi due anni che l’enhancer HS1.2 favorisce l’insorgere di altre malattie autoimmuni come l’artrite reumatoide e la sclerodermia, ma soltanto in quest’ultimo studio è stato possibile definire, grazie anche alla cooperazione di ricercatori statunitensi, il meccanismo attraverso il quale l’enhancer genera la maggiore predisposizione alla malattia autoimmune.
«La nostra speranza, prima neppure ipotizzabile – ha spiegato Ferraccioli - è che bloccando l'enhancer HS1.2, o il suo effetto su Nf-KB, con farmaci specifici si possa fermare la malattia senza dover ricorrere a farmaci immunosoppressori o ad altre terapie che presentano non pochi effetti collaterali. Intanto – ha concluso – la scoperta del ruolo di questo enhancer permetterà di classificare in modo più accurato i pazienti e quindi formulare una prognosi più precisa indirizzandosi verso cure più personalizzate».
ARTRITE INFETTIVA - Si intendono manifestazioni artritiche che conseguono all’infezione da parte di un microorganismo, generalmente di natura batterica, e che tende a replicarsi nell’ambito del liquido sinoviale dell’articolazione causando l’emersione di un processo flogistico acuto. Generalmente le artriti si manifestano come complicanza secondaria ad un focolaio primario sviluppatosi nell’organismo. L’agente infettivo tende a raggiungere l’articolazione principalmente per via ematica (60%) o per passaggio da tessuti molli adiacenti (20%), e prolifera nel liquido sinoviale determinando lo sviluppo di una sinovite con infiltrato cellulare e l’assunzione da parte dello stesso liquido di un aspetto purulento. La classificazione storica consente di distinguere artriti di natura gonococcica da artriti di natura non gonococcica. In quest’ultimo caso i pazienti sono nei 2/3 persone di età adulta.
L’artrite da Neisseria Gonorrea è provocata da un diplococco gram-negativo avente al microscopio un aspetto a chicco di caffè. Cresce su terreni Agar Cioccolato ed è relativamente fragile. E’ responsabile di una malattia clinica a trasmissione venerea e che vede inizialmente un coinvolgimento dell’apparato genito-urinario e solo successivamente un coinvolgimento di altri tessuti. L’artrite colpisce come complicanza prevalentemente le donne laddove i sintomi iniziali di infezione gonococcica genitourinaria sono più attenuati o assenti. Dopo due-tre settimane dall’infezione si sviluppa un rash cutaneo papuloso non pruriginoso talvolta di lieve entità. A questi si accompagna una monoartrite del ginocchio o del polso con tenosinovite del dorso della mano o del piede, oligoaltralgia migrante e rialzo febbrile. La conferma diagnostica si ottiene mediante artrocentesi che rileva la presenza di un liquido francamente purulento.
Le artriti settiche di natura non gonococcica sono determinate da numerosi microrganismi patogeni. Nel 60% dei casi i pazienti presentano artrite causata da Stafilococco Aureo, mentre nel 20% dei casi i batteri infettanti sono Streptococco, Haemofilus Influenza, Esterichia Coli, Pseudomonas Aeruginosa. Più rari ma più lesivi sono i Clostridi, che crescono rapidamente in aree anaerobe e sono i principali responsabili dei casi di artriti periprotesiche, artriti nel diabete e artriti postoperatorie.
Il quadro clinico generalmente consiste in una monoartrite acuta o subacuta con i tipici segni di flogosi. L’articolazione è dolente e tumefatta. Nel neonato la sede più colpita è l’anca, e spesso è difficile il riconoscimento di segni di flogosi in tale area. Nell’adulto le sedi più colpite sono le grosse articolazioni degli arti, in particolare ginocchia, anca, caviglia, spalla e gomito. Più raro l’interessamento vertebrale o sacroiliaco. Le forme poliarticolari con il coinvolgimento di più articolazioni sono molto gravi e portano ad exitus nel 25% dei casi. La diagnosi viene svolta con artrocentesi in condizioni di asepsi e identificazione del germe nel campione sia mediante microscopia diretta, sia mediante tecniche immunologiche e coltura in terreni appositi. Inoltre, si ha febbre, elevazione degli indici di flogosi e in particolare della proteina C reattiva, percentuale nel liquido sinoviale di granulociti polimorfonucleati superiore al 90%.
Alcuni meritano una menzione particolare per via della loro aggressività: Brucella, Mycobacterium Tubercolosis e Borrelia.
La brucellosi presenta una manifestazione clinica primaria comprendente febbre dapprima continua e violenta in seguito ondulante e atipica, con epatomegalia, splenomegalia, linfadenopatia, pan citopenia e linfopenia. L’artrite da brucellosi nel bambino si rivela con una oligoartrite colpente le grandi articolazioni degli arti, mentre nell’adulto si rivela principalmente come una sacro ileite asimmetrica monolaterale che dona un quadro clinico tipico di lombalgia infiammatoria. L’interessamento vertebrale con spondiloartrite tende a determinare grave erosione del tessuto osseo e comparsa di materiale ascessuale perivertebrale. La diagnosi di malattia si attua mediante dosaggio sierologico del titolo anticorpale specifico per gli antigeni di brucella e che sarà superiore a 1 su 160, nonché con prelievo di materiale ascessuale e esame colturale.
La tubercolosi osteoarticolare complica il 3% delle infezioni tubercolari e in particolare un coinvolgimento articolare si verifica in soggetti in prima e seconda decade di vita, defedati o immunocompromessi o in trattamento farmacologico. La malattia si manifesta nel 85% dei casi come una monoartrite periferica e asimmetrica colpente il ginocchio o le anche. Nel 15% dei casi la malattia si manifesta come morbo di Pott o spondilite tubercolare con coinvolgimento delle vertebre del tratto lombare alto e dorsale basso, segni tipici di erosione a carico del margine anteriore e presenza di ascessi freddi perivertebrali. Clinicamente l’artrite si manifesta in modo subdolo con la comparsa di dolore solo in fase avanzata, laddove si può arrivare ad un collasso vertebrale con cifosi accentuata. Conferma diagnostica si ha con esame radiografico che tuttavia mostrerà i segni di erosione solo in una fase già avanzata, esame TAC che invece è molto più precoce, prelievo di campione ascessuale, con prelievo di campione bioptico della membrana sinoviale dove si rinverranno i caratteristici granulomi tubercolinici caseosi. Il mycobacterium può dare anche osteomielite e dattilite con radiologicamente la comparsa di erosioni litiche a carico dell’osso accompagnate da reazione periostale. Più raramente il batterio può dare tendiniti o borsiti.
La Borrelia è una spirocheta e ha anche esso un meccanismo di resistenza alla fagocitosi che le consente di sopravvivere all’interno dei macrofagi per lungo periodo di tempo. La Borreliosi può determinare a mesi di distanza rispetto alla sintomatologia connessa all’inoculazione del batterio mediante puntura di zecca (Eritema migrante, linfocitoma cutis, acrodermatite, paralisi di nervi cranici o nevrite di nervi spinali con possibile sviluppo di meningite linfocitaria, cardite con possibili turbe di conduzione). L’eritema migrante è una macula-papula eritematosa e poco dolorosa che si forma nel punto di iniezione pochi giorni dopo il morso di zecca e che tende a espandersi concentricamente. Il linfocitoma cutis è un nodulo sottocutaneo duro che si forma in alcune aree della cute quali naso orecchio avambracci e mammelle. La manifestazione clinica consiste in una monoartrite o oligoartrite a carico delle grandi articolazioni degli arti inferiori, in particolare anca e ginocchia, con voluminosa produzione di liquido sinoviale che nelle ginocchia può dar luogo alla comparsa di cisti sinoviali poplitee. Il liquido sinoviale è flogistico ma non purulento. Solitamente tale infiammazione sinoviale non ha un andamento destruente. Conferma diagnostica si ottiene mediante dosaggio degli anticorpi specifici espressi verso antigeni di Borrelia, laddove gli anticorpi IgM tendono a comparire dopo 3-4 settimane e a raggiungere un picco in 6-8 settimane.
ARTRITE REATTIVA
Con tale termine ci si riferisce ad un’insieme di artriti le quali non sono sostenute direttamente da un agente eziologico specifico ma traggono origine in modo successivo ad un evento infettivo a carico di tessuti estranei all’apparato locomotore, quali ad esempio infezioni genitourinarie o gastroenteriche. Alla base si ha un fenomeno di crossreattività immunitaria, confermata dall’elevata (circa il 50%) associazione fra soggetti affetti da artrite reattiva e portatori di aplotipo HLAB27. L’infiammazione dell’articolazione viene quindi sostenuta da un meccanismo autoimmune che vede la presenza di linee cellulari o anticorpi espressi verso antigeni del microorganismo eliminato nonché verso antigeni della membrana sinoviale quale proteoglicani o aggregani. Nelle artriti reattive il batterio generalmente non è presente (oppure se presente in piccole quantità, non è vitale) nell’articolazione, per cui la terapia antibiotica ha un ruolo marginale, indicata solo per aiutare l’eradicazione rapida del focolaio primario, la cui persistenza aumenta le probabilità di sviluppo di crossreattività. Un ulteriore meccanismo patogenetico potrebbe essere correlato alla sopravvivenza dei microrganismi in quantità modiche grazie ad un’elevata patogenicità e ad una resistenza opposta alla fagocitosi (Borrelia, Clamidia Trachomatis) per cui questi sarebbero in grado di indurre infiammazione infettando direttamente la membrana sinoviale e suscitando quindi crossreattività autoimmune.
Il reumatismo post faringitico, o reumatismo articolare acuto, è una malattia infiammatoria multi sistemica la quale viene evocata in seguito ad una faringite sostenuta da un batterio streptococco beta-emolitico del gruppo A. La malattia viene scatenata o riaccesa dall’intervento di ceppi streptococcici con specifici fattori di virulenza e in grado di stimolare la produzione di anticorpi cross-reattivi con particolari tessuti dell’ospite. Il fenomeno di mimetismo molecolare viene amplificato da una esagerata risposta immunomediata delle cellule T. Gli anticorpi reagiscono contro antigeni della sinovia, antigeni del tessuto cardiaco, antigeni dei neuroni dei nuclei encefalici della base. Un tempo manifestazione molto frequente, l’avvento della terapia antibiotica nei paesi evoluti ha consentito di ridurre l’incidenza ad 1 caso su 100000. La RAA come la glomerulonefrite poststreptococcica colpiscono entrambi i sessi con un picco di incidenza fra i 5 e i 15 anni di età. A livello locomotore è possibile osservare lo sviluppo di una monoartrite asimmetrica e migrante e a carico delle grandi articolazioni, accompagnata da febbre elevata. Solitamente la flogosi articolare si risolve senza lasciare reliquati. La malattia RAA interessa più organi e tessuti. A livello cardiaco può provocare pericardite, endocardite e miocardite, quest’ultima più frequente e a prognosi più grave perché nel 10% dei casi evolve verso lo scompenso cardiaco; A livello del sistema nervoso è rara la comparsa di Corea di Sydenham. A livello cutaneo si osserva comparsa di eritema marginato e noduli sottocutanei sulle superfici estensorie e sulle protuberanze ossee. La diagnosi si attua mediante anamnesi ed esame obiettivo, in laboratorio si ha elevazione indici flogosi e in particolare della PCR, con aumento dei titoli anticorpali verso lo streptococco, in particolare si ha elevazione dei titoli verso la Streptolisina O con picco a 4 settimane dall’infezione. Può esservi leucocitosi neutrofila, lieve anemia normocromica e normocitica. La radiografia articolare e l’ecografia dei distretti articolari nonché lo studio del liquido sinoviale serve solo nell’ambito di una diagnosi differenziale problematica. L’istologia su campione bioptico permette di osservare un infiltrato infiammatorio con linfociti e macrofagi che si organizzano nei noduli di Aschoff.
Le artriti reattive post uretritico/dissenteriche sono delle artriti asettiche generate da una risposta immunitaria cross-reattiva rivolta verso strutture articolari, entesiche e extra articolari in seguito a stimolazione da parte di un microorganismo che abbia infettato la mucosa intestinale o urogenitale. Si manifesta con un tempo di latenza di circa 4 settimane rispetto all’episodio clinico legato al focolaio infettivo primario. La triade clinica “congiuntivite, artrite e uretrite/enterite” ha anche il nome di Sindrome di Reiter. Tali artriti insorgono tipicamente nei giovani adulti, in misura simile nei due sessi, in circa il 10-15% dei soggetti infettati. Le forme di tipo spondilitico si associano fino al 50% dei casi con il gene HLA B27, più spesso con il sottotipo B27-05, la presenza di tale allele conferisce non solo suscettibilità a sviluppare una artrite reattive secondaria a infezione enterica o genitourinaria con un rischio 50 volte più elevato del normale, ma anche un rischio di andare incontro a recidive e a cronicizzazione. Tuttavia una quota rilevante di malati non possiede il gene HLA-B27 per cui probabilmente esistono altri fattori genetici influenti.
A livello intestinale i microrganismi tipicamente implicati sono alcuni enteropatogeni gram-negativi che comprendono Salmonella typhimorium e enteritidis, la Yersinia enterocolitica, la Shigella flexneri e dysenteria, il Campylobacter jejuni, il Clostridium difficile. Perl e infezioni urogenitali sono implicati la Chlamydia trachomatis e l’Ureaplasma urealyticum. Le infezioni mucosali indotte da tali agenti inducono la produzione di anticorpi specifici, specialmente di classe IgA, e risposte di tipo cellulare.
In ambito reumatologico il quadro clinico più comune è quello di una oligoartrite acuta, asimmetrica e interessante le articolazioni periferiche, con tendenza ad estendersi in modo centripeto. Si ha un andamento sostitutivo nella fase acuta iniziale mentre si ha un andamento aggiuntivo nelle forme croniche. Le articolazioni più frequentemente interessate dalla forma acuta sono quelle dell’anca, del ginocchio e la tibio-tarsica. Le articolazioni coinvolte presentano marcati segni di flogosi ed eritema della cute sovrastante. Frequente è l’interessamento di entesi e tendini; la fascite plantare e la tendinite achillea o la borsite del’anca possono determinare notevole impotenza funzionale. L’artrite acuta ha una evoluzione benigna e si ha una remissione spontanea entro alcune settimane di vita. Nella forma cronica il quadro è di tipo poliartricolare e interessa più frequentemente anche gli arti superiori e la colonna vertebrale, con interessamento spondilitico che ripete le manifestazioni della spondilite anchilosante, sebbene rispetto a questa malattia siano più frequenti le espressioni monolaterali e quindi asimmetriche del danno articolare o entesico-ligamentoso (sacroileite e desmofiti).
In ambito patologico il quadro clinico vede la presenza di numerose manifestazioni extra articolari, quali in particolare:
§ congiuntivite (sterile e simmetrica, a remissione in un mese)
§ uveite anteriore acuta (circa 20% di pazienti soprattutto se HLA-B27)
§ cheratoderma pseudo-blenoraggico (lesioni con papule eritematose al palmo mani e pianta piede)
§ balanite circinata (eruzione eritematosa nel glande)
§ onicopatia (ispessimento unghia)
§ pericardite (rara)
§ disturbi della conduzione atrioventricolare (rara)
§ aortite (rara)
La conferma della diagnosi si ottiene mediante esame di laboratorio e esame strumentale. Gli indici di flogosi sono aumentati. Il liquido articolare è di tipo infiammatorio ma non purulento. Le alterazioni radiografiche sono riscontrabili soprattutto nelle forme croniche e riguardano i segmenti articolari interessati dal processo con erosioni marginali della corticale dell’osso e fenomeni di proliferazione ossea con esostosi e periostite diafisaria. Si riscontrano segni di entesite con erosioni e speroni ossei, talvolta esuberanti e frequenti a livello calcaneare e della tuberosità ischiatica. L’interessa assiale si manifesta con la formazione di ponti ossei (sindesmofiti) tra le vertebre, più spesso monolaterali e a disposizione asimmetrica, e incompleti, e presenti soltanto in zona dorso lombare (netta quindi la differenza con la spondilite anchilosante che invece ha interessamento più esteso e sindesmofiti più sottili e completi e bilaterali). L’indagine con Tac e risonanza è fondamentale per la valutazione di una artrite reattiva acuta poiché consente di individuare la presenza di edema osseo e segnalare dunque il problema prima che si verifichino alterazioni della struttura. SPONDILOARTRITE SIERONEGATIVA
Con tale termine si indica un ampio gruppo di artropatie caratterizzate da un coinvolgimento infiammatorio della colonna vertebrale e da una sieronegatività espressa verso il fattore reumatoide. Fanno parte: spondiloartriti indifferenziate, spondilite anchilosante, artrite psorisiaca, artriti reattive croniche, artriti enteropatiche. Ulteriori caratteristiche anatomopatologiche in comune consistono in un coinvolgimento delle strutture periarticolari con tendiniti e entesiti, una frequente monoartrite asimmetrica degli arti inferiori e il possibile interessamento di distretti extra articolari. Clinicamente il coinvolgimento assiale vede l’emersione di infiammazione nella parte lombare della colonna nonché delle articolazioni sacroiliache. Una sacroileite monolaterale è spesso l’evento infiammatorio iniziale.
Nelle spondiloartriti si ha quasi sempre un interessamento infiammatorio primario a carico dei tendini e delle entesi con una chiara manifestazione clinica di dolore e ridotta funzionalità quando le tendiniti/entesiti sono spontanee, croniche e ricorrenti. Un ulteriore segno consiste nella comparsa di dattilite con “dita a salsicciotto”, cioè una tumerazione con rossore di una o più dita della mano in risposta ad una infiammazione dei tendini estensori e della membrana sinoviale delle articolazioni interfalangee o metacarpofalangee.
Segni extra articolari di spondiloartriti sieronegative possono verificarsi con infiammazioni a carico di distretti quali l’occhio (uveite anteriore), la cute e le mucose (psoriasi, cheratoderma, eritema nodoso, aftosi), più raramente il cuore (endocarditi con valvulopatie, aortite ascendente) o i polmoni (fibrosi polmonare interessante più spesso i lobi superiori).
L’eziologia risulta essere multifattoriale: si ha un substrato genetico su cui si stabiliscono un serie di fattori ambientali fra cui un evento infettivo “firestarter” che determina l’emersione di crossreattività immunitaria di tipo cellulare. Il meccanismo patogenetico di base consiste nell’emersione di una reattività autoimmune verso peptidi artritogeni self della cartilagine articolare e del tessuto connettivo delle entesi, sostenuta da linfociti T CD8 citotossici. Un ruolo importante nella cronicità del processo infiammatorio è dettato dalle citochine prodotte, in particolare TNF-alfa.
Il substrato genetico influente nel meccanismo è confermato dall’elevatissima percentuale di associazione fra spondilite anchilosante e aplotipo HLA-B27. Nelle altre forte di spondiloartriti, l’associazione scende dal 50% al 20%, soprattutto è presente in relazione ad un coinvolgimento del rachide.
La spondilite anchilosante è una malattia infiammatoria cronica dello scheletro assiale (colonna vertebrale e articolazioni sacroiliache, frequentemente articolazioni scapoloomerale e coxofemorale, più raro l’interessamento delle articolazioni appendicolari) classificata nell’ambito delle spondiliti sieronegative. Ha un’età di esordio intorno a 25 anni, quindi nella seconda decade di vita, e una leggera prevalenza nei soggetti maschili laddove la malattia ha un andamento più aggressivo rispetto alle donne. Nel meccanismo patogenetico di base ha elevata importanza la componente genetica, in quanto si ha una associazione fra spondilite anchilosante e aplotipo HLAB27 del 95% (in particolare sono coinvolti i sottotipi HLAB27-06 e HLAB27-09) oltre che una associazione meno frequente con l’aplotipo HLA-B60. Probabilmente il meccanismo firestarter determinante l’emersione di crossreattività è sostenuto da infezioni di natura batterica a carico del lume intestinale. Topi transgenici con aplotipo hla-b27 non sviluppano spondilite anchilosante qualora si mantenga un lume intestinale sterile, e inoltre si ha negli umani affetti una presenza di infiammazione intestinale cronica nel 50% dei casi esaminati.
A livello anatomopatologico è possibile evidenziare una infiammazione coinvolgente i tendini e il tessuto fibrocartilagineo con un processo destruente che comporta l’emersione di tessuto di granulazione neovascolarizzato e che esita in fibrosi, calcificazioni e neoformazione di osso. Quindi differisce rispetto all’artrite reumatoide (in cui si ha un maggiore interessamento infiammatorio della membrana sinoviale). A livello del tessuto è osservabile un infiltrato linfocitario e plasmacellulare con possibile sviluppo di follicoli linfoidi.
Clinicamente si osserva nel 75% dei casi come prima manifestazione un esordio di rachialgia di tipo infiammatorio. Come primo e precoce reperto clinico si ha un dolore lombosacrale ad esordio insidioso e associato a rigidità mattutina. Dapprima monolaterale e discontinuo, il dolore tende a farsi persistente e bilaterale per poi risalire verso l’are vertebrale lombare e toracica, mentre nelle donne frequentemente si può osservare l’emersione di una cervicalgia tendente a discendere in senso caudale. Quindi nell’uomo si verifica quasi sempre un andamento ascendente, nelle donne può verificarsi anche un andamento di tipo discendente dalle vertebre cervicali verso le toraciche e lombari. Il dolore si associa a rigidità mattutina (di durata inferiore rispetto all’artrite reumatoide) e tende a migliorare con l’esercizio fisico. In una piccola percentuale dei casi si può avere come manifestazione precoce la comparsa di una sacroileite monolaterale o di una infiammazione coxofemorale e il paziente riferisce dolore all’arto inferiore simile alla sciatica ma mozza poiché si sofferma a livello del ginocchio. Il dolore è particolarmente invalidante. Infine, l’interessamento delle articolazioni della gabbia toracica possono mimare una sindrome anginosa.
Nella spondilite vertebrale il dolore scaturisce da infiammazione dei legamenti posteriori del bacino, dall’artrite alle articolazioni interapofisarie, disco vertebrali e costo vertebrali, dalle entesiti vertebrali. La rigidità scaturisce inizialmente dallo spasmo della muscolatura perivertebrale, mentre in fase avanzata si osserva una rigidità irreversibile dettata dall’anchilosi a carico delle articolazioni. In fase avanzata si osserva come l’anchilosi porta ad un cambiamento posturale del soggetto, con un appiattimento della curva/spina lombale a fronte di una accentuazione della curva toracica e cervicale, si ha cifosi accentuata con il capo rivolto in avanti, un respiro di tipo addominale con appiattimento toracico, il paziente ha difficoltà a sollevare il capo e per mantenere l’equilibrio presenta una leggera flessione delle gambe, ha una perdita di escursione visiva perché non può sollevare il capo. In fase avanzata il dolore e la rigidità mattutina tendono a recedere ma si mantiene la perdita funzionale e la rigidità dell’anchilosi.
Manifestazioni extralocomotorie vedono la comparsa di sintomi sistemici quali febbre e astenia, possibile sviluppo di uveite anteriore (nel 25% dei casi e associati a HLA-B27) la quale si presenta dapprima monolaterale e lieve e reversibile, in seguito diviene bilaterale e più aggressiva fino a poter apportare danni al visus del soggetto. Più raramente si osserva interessamento polmonare e cardiaco. L’interessamento neurologico si verifica solitamente in modo secondario all’artrite e all’anchilosi vertebrale laddove si possono avere patologie a carico dei nervi spinali (collasso vertebrale con schiacciamento delle radici), a carico del tronco encefalico (sublussazione atlanti dea) e sindrome da cauda equina.
Il sospetto diagnostico si attua mediante anamnesi di rachialgia in soggetto giovane e mediante esame obiettivo. Il laboratorio di analisi offre la presenza di
1- aumento di VES e di PCR (75% dei casi, utile nel valutare il followup)
2- aumento fosfatasi alcalina
3- aumento IgA sieriche (dovute all’enteropatia che poi scatena la reazione infiammatoria)
4- talvolta anemia normocromica e normocitica
5- tipizzazione HLA (molto predittiva per spondilite)
La conferma diagnostica si ottiene mediante esame strumentale. Attualmente si utilizza una risonanza magnetica la quale consente di ottenere informazioni in merito alle fasi precoci di infiammazione sacro ileale o lombare in quanto sottolinea la presenza di edema midollare osseo. La radiografia permette di ottenere informazioni principalmente in una fase avanzata della malattia. In fase precoce nella sacroileite si osserva perdita dei margini dei capi articolari con sclerosi dell’osso sub condrale, lo spazio intraarticolare tende dapprima ad allargarsi per poi obliterarsi tramite tessuto osteofibroso fino all’anchilosi. In fase precoce di spondilite si osserva la presenza di piccole erosione degli angoli dei corpi vertebrali che appaiono più lucidi (fenomeno dello “shiny corners”), si ha inoltre perdita del normale contorno del corpo anteriore con presenza di un corpo vertebrale “squadrato” e fenomeni di ossificazione dello strato superficiale dell’anulus fibrosus con comparsa di sindesmofiti sottili e bilaterali generalmente interessanti tutto il tratto vertebrale infiammato. In fase avanzata l’ossificazione dei legamenti spinali interapofisari porta a una fusione della colonna vertebrale con la spina “a canna di bambù”. In caso di immobilità sono presenti segni di osteoporosi.
La diagnosi differenziale viene posta con: rachialgie di natura infettiva, postinfettiva o degenerativa o neoplastica (esarcebazione del dolore all’esercizio fisico e sindesmofiti più voluminosi), malattia di Forestier o iperostosi anchilosante del disco intervertebrale o DISH (generalmente sono scarsi i segni di flogosi e non vi è aplotipo B27).
L’artrite psorisiaca appare nel 30% dei pazienti psorisiaci. La psoriasi è una malattia infiammatoria cronica della cute a eziologia sconosciuta e che si rivela clinicamente con l’emersione di eruzioni papulari tendenti ad associarsi in placche che desquamano. Le placche sono di colore rosso vivo e tendono a localizzarsi a livello del cuoio capelluto e della superficie estensoria degli arti. La psoriasi cutanea presenta una elevata associazione con aplotipi HLA-B13 HLA-B17 e HLA-C6. Eventuale interessamento spondilitico presenta una associazione con HLA-B27 e HLA-DR4.
Nell’artrite psorisiaca vengono colpiti, oltre ai cheratinociti, anche le cellule sinoviali e il connettivo delle entesiti. Le entesiti sono molto frequenti e la lesioni si sviluppa in due fasi: la prima fase infiammatoria in cui si ha un riassorbimento osseo e la comaprsa di infiltrato cellulare, nonché una seconda fase ripartiva in cui si ha formazione di sindesmofiti con fusione articolare. La membrana sinoviale va incontro a ipertrofia con comparsa di villi, tuttavia non si sviluppa mai un “panno sinoviale”. L’infiltrato infiammatorio è costituito da linfociti in sede periva sale, plasmacellule secernenti IgA e IgG nonché ispessimento parietale delle arteriole. E’ possibile osservare erosione dell’osso sub condrale e della cartilagine.
Le manifestazioni cliniche correlate a psoriasi sono piuttosto polimorfi. Abbiamo principalmente tre quadri:
1- forma classica
2- forma artritica senza psoriasi
3- forma artritica precoce in psoriasi recente
Nella forma classica si osserva nel 50% un interessamento assiale con spondilite avente una distribuzione casuale di sindesmofiti e impegno sacroiliaco unilaterale. Nel 20% si ha una spondilite con impegno poliarticolare periferico. Nel 10% si ha una dattilite e dito a salsicciotto con impegno artritico delle articolazioni interfalangee la quale raramente può esitare in una forma “mutilante” nella quale si ha osteolisi a carico dei capi ossei, più spesso delle estremità delle falangi.
La forma di artrite psorisiaca senza psoriasi esordisce generalmente come dattilite e coinvolge le articolazioni interfalangee. Nella forma di artrite precoce si ha interessamento interfalangeo con andamento poliarticolare.
La diagnosi viene sospettate su base anamnestica e esame obiettivo, riscontrando psoriasi cutanea, dolore e tumefazione delle articolazioni coinvolte, rachialgia. Il laboratorio segnala aumento indici di flogosi, aumento dell’uricemia per aumentato turnover delle cellule della cute, assenza di fattore reumatoide nel siero. La conferma si ha tramite reperto strumentale in Risonanza magnetica o in Radiografia con segno di artrite erosiva della piccole articolazioni e sindesmofiti nella colonna.
L’artrite enteropatica è una forma di manifestazione reumatologica che si esprime in soggetti affetti da malattie infiammatorie croniche su base autoimmune quali la Rettocolite ulcerosa, la Celiachia e il Morbo di Crohn. Può verificarsi anche in un periodo postoperatorio a seguito di un intervento di bypass gastrico o enterico. L’eziologia è sconosciuta, il meccanismo patogenetico è di tipo autoimmune laddove si verifica una ricircolazione di linfociti T attivati a livello del tessuto mucosale per reattività autoimmune (probabilmente dovuta ad una crossreattività con antigeni di natura batterica) e che andrebbero a determinare l‘emersione di infiammazione autoimmune anche a carico delle strutture articolari, in particolare i sinoviociti. Dal punto di vista clinico è possibile distinguere tre forme di artrite enteropatica:
1- TIPO 1 , con oligoartrite acuta e autolimitante il cui decorso è strettamente correlato all’enteropatia
2- TIPO 2, poliartrite cronica e non autolimitante, il cui decorso non è correlato all’enteropatia
3- TIPO 3, spondilite con rachialgia e frequente interessamento articolazioni periferiche e associazione a HLA-B27
La celiachia occulta non diagnosticata può determinare nel 25% dei casi l’emersione di una artrite enteropatica di tipo 1 tendente al tipo 2, tuttavia la sospensione dell’assunzione di cibi contenenti glutine tende a risolvere nell’arco di poche settimane l’infiammazione e la sintomatologia. Recenti studi hanno suggerito il ruolo di alcuni fattori genetici che indurrebbero un aumento dell’espressione immune nei confronti di antigeni batterici causando un’attivazione policlonare e un maggior rischio di reattività autoimmune. In paricolare il gene NOD2/CARD15 il cui prodotto legherebbe i lipopolisaccaridi batterici nelle cellule fagocitarie aumentandone il tempo di esposizione.
ARTRITE REUMATOIDE
Malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce elettivamente le articolazioni e l’osso subcondrale, ma può interessare vari tipi di tessuti dando manifestazioni cliniche sia articolari che extra articolari. Ha una diffusione ubiquitaria, interessa lo 0,5% della popolazione mondiale, la prevalenza aumenta con l’aumentare dell’età. Ha una maggiore incidenza nei soggetti di sesso femminile con un rapporto femmina:maschio di 4 a 1. Le complicanze extraarticolari sono più frequenti nei soggetti maschi.
L’eziologia è sconosciuta, il meccanismo patogenetico è di tipo autoimmune. L’associazione più forte è con l’aplotipo DR4. A livello istopatologico a carico dell’articolazione si verifica una iperplasia della membrana sinoviale con angiogenesi riguardante la sinovia e la cartilagine, nonché infiltrato di cellule infiammatorie che spesso si associano a formare strutture follicolari. Queste tre caratteristiche determinano iperplasia e ipertrofia della sinovia, edema e infiammazione del tessuto articolare che assume un aspetto simil-neoplastico benigno e con aspetti di invasività. Si verifica erosione di cartilagine e dell’osso subcondrale, la membrana sinoviale tende a invadere tali tessuti formandovi all’interno delle pseudo cisti. Si sottolinea l’importanza, nel processo autoimmune, della reazione infiammatoria TH1 mediata (sebbene vi sia anche una partecipazione autoanticorpale) nonché della secrezione di citochine pro infiammatorie. TNF-alfa è responsabile dell’effetto flogistico, IL-1 è responsabile della erosione e della demolizione proteoglicanica.
La manifestazione clinica primaria consiste in un interessamento infiammatorio con tumefazione e dolore e rigidità sia funzionale sia al mattino della durata maggiore di 30 minuti, riferita alle articolazioni quali:
1- le interfalangee prossimali 2° e 3°
2- le metacarpofalangee e metatarsofalangee (2° e 3)
3- polsi e caviglie
Normalmente nel 70% dei casi ha un esordio lento e graduale con andamento altalenante e progressivo. Inoltre ha un andamento simmetrico e aggiuntivo in senso centripeto, cioè nel corso del tempo interessa più articolazioni senza risoluzione dell’infiammazione delle precedenti. La malattia nel 5-10% dei casi è monociclica e tende a regredire, cosi come nel 10% può avere un andamento molto aggressivo, di tipo acuto o subacuto. Poco frequentemente può avere un esordio simil-polimialgico (con dolore riferito ai cingoli scapolare e pelvico) oppure di tipo palindromico (con episodi di monoartrite temporanea cioè di 3 giorni circa).
Clinicamente il paziente riferisce dolore e rigidità mattutina della durata superiore a mezz’ora. La rigidità è sempre presente, è più accentuata al mattino e limita la funzione articolare. E’ dettata inizialmente dalla raccolta di liquido conseguente a sinovite e dallo spasmo muscolare, in seguito per la ipertrofia sinoviale e per la ipotrofia della muscolatura articolare. Il dolore è sempre presente: durante la notte, al risveglio, all’attività funzionale, con carico di peso. Come sintomi sistemici, il paziente riferisce astenia, febbricola, calo ponderale. La sinovite è causa di tumefazione e può portare all’ipertrofia con formazione di un “panno sinoviale” che è un segno patognomico di artrite reumatoide. Progressivamente alla perdita funzionale si associa una deformità della articolazione e dell’arto colpito.
I seguenti distretti vengono più comunemente colpiti:
MANI: in fase precoce si ha infiammazione delle articolazioni interfalangee prossimali e metacarpofalangee, quasi sempre vengono risparmiate le interfalangee distali. Il permanere della tumefazione infiammatoria può portare a deformità delle dita o della mano.
Le “dita a colpo di vento” vengono generate dalla sublussazione articolare con stiramento e scivolamento dei tendini interfalangei estensori.
Le dita “a collo di cigno” vedono una iperestensione delle IFP e flessione delle IFD.
Le dita a “asola” vedono flessione della IFP e estensione delle IFD.
Il pollice “a zeta” vede una flessione della prima articolazione metacarpofalangea e ipertensione della IF.
La mano “a gobba di dromedario” vede una sublussazione volare delle ossa metacarpali sulle carpali e delle falangi sulle metacarpali.
POLSI: altro distretto frequentemente interessato da flogosi, si può avere una sublussazione articolare del lato ulnare causando un aspetto “a mano benedicente”. Il segno del “tasto del pianoforte” indica una riduzione manuale temporanea della sublussazione distale dell’ulna.
GOMITI E SPALLE E ANCHE: vengono coinvolte principalmente in fase avanzata e in età senile. Si ha rigidità funzionale con comparsa di tumefazioni dolorose (ad esempio nella fossetta paraolecranica del gomito), ridotta mobilità attiva e passiva e anchilosi progressiva. Il dolore all’anca si presenta a livello gluteo o inguinale.
GINOCCHIO: viene coinvolto precocemente, si ha panno sinoviale con tumefazione osservabile a livello della fossetta poplitea e tendenza verso la perdita di coincidenza degli assi con ginocchia in valgismo (allontanamento) o in varismo (avvicinamento). E’ possibile osservare l’emersione di cisti sinoviali dette “cisti di Baker” che possono dare fenomeni compressivi ed edemi da stasi.
CAVIGLIA: viene coinvolta precocemente nelle forme più aggressive, si ha tumefazione perimalleolare e periachillea con limitazione funzionale flessoestensoria. Si può avere pronazione o eversione del piede (cioè perdita dell’asse proprio fra piede e polpaccio) con difficoltà alla deambulazione. Si possono avere fenomeni compressivi riguardanti i vasi e con comparsa di segni di stasi al piede.
PIEDE: si ha interessamento delle articolazioni metatarsofalangee 2° e 3°, con appianamento della arcata plantare, sublussazione plantare e deformità progressiva in valgismo dell’alluce. Il piede reumatoide può assumere una conformazione “triangolare” oppure una conformazione “martello” per via di una sublussazione plantare che porta a iperestensione delle metatarsofalangee e flessione delle interfalangee. Si può avere anche dolorabilità per lo sviluppo di “sindrome del tunnel tarsale”.
RACHIDE: non frequentemente coinvolta, un suo eventuale processo infiammatorio può portare a gravi conseguenze dal punto di vista neurologico per via della progressiva compressione e deformazione esercitata dal panno sinoviale. Si può avere una sinovite atlantido-odontoidea con erosione del dente dell’epistrofeo e lassità del legamento straverso del dente con possibile sublussazione posteriore e compressione midollare, in questo caso il sintomo riferito è di rigidità al collo e cefalee occipitali molto forti e possibili parestesie periferiche. Alcuni sintomi possono essere legati a compressione dei vasi vertebrali.
Possibili manifestazioni extra articolari possono essere riscontrate fino al 50% dei pazienti esaminati e in particolare si osservano in pazienti cronici con AR di lunga durata. Fattori predittivi di possibili manifestazioni extraarticolari sono indicati nel sesso maschile e negli aplotipi HLA-DR1 e HLA-DR4.
CUTE: è possibile osservare lo sviluppo di tipici noduli reumatoidi localizzati nel sottocute in aree adiacenti alle articolazioni infiammate o in aree a maggiore pressione. Sono noduli duro-elastici e adesi ai tessuti, con un’area centrale di necrosi fibrinoide circondata da una capsula di collagene. Tendono a regredire nelle fasi di remissione dell’artrite ma possono esacerbarsi in corso di terapia con metotrexano. Possono essere rimosse chirurgicamente ma tendono a recidivare. Inoltre, a livello cutaneo non è infrequente la comparsa di manifestazioni vasculitiche correlate alla presenza del fattore reumatoide. Si esprimono come rash, porpore o raramente lesioni ulcerative.
MUSCOLI: l’astenia con comparsa di dolori acuti improvvisi rappresentano dei sintomi caratteristici riferiti da pazienti affetti da AR. Spesso i dolori sono predittivi di una ripresa della patologia infiammatoria articolare. Spesso si osserva ipotrofia della muscolatura periarticolare o interossea, descrivibile con il “Squeeze Test” cioè il test di compressione laterolaterale della mano o del piede (se ipotrofia e infiammazione il soggetto riferisce dolore molto acuto).
OSSA: è possibile osservare osteoporosi nell’area ossea partecipante o adiacente all’articolazione infiammata, secondaria al processo infiammatorio o alla cura farmacologica con corticosteroidi.
VASI: è frequente il riscontro di malattie cardiovascolari dettate da una accelerazione del processo di aterosclerosi. Una donna affetta da AR presenta una probabilità da 10 a 50 volte superiore di sviluppare un evento cardiovascolare.
POLMONE: l’interessamento è poco frequente, si possono osservare pleurite, interstiziopatia polmonare e pneumopatia nodulare. L’interstiziopatia polmonare è una delle manifestazioni più severe, si ha la presenza all’ascultazione di crepitii con reticolo interstiziale diffuso all’esame radiografico. Il paziente tende a presentare dispnea da sforzo progressivamente ingravescente. La pneumopatia nodulare vede la presenza di piccoli noduli di dimensioni variabili, raramente vanno incontro ad escavazione o a calcificazione e generalmente sono asintomatici. La pleurite si verifica in modo asintomatico nel 20% dei casi.
CUORE: La pericardite si verifica frequentemente ma si mantiene asintomatica nella maggior parte dei casi e raramente si verificano casi di tamponamento cardiaco o pericardite costrittiva. Rare sono le valvulopatie granulomatose o l’interessamento miocardico con aritmie.
OCCHIO: si verificano nel 20% dei casi manifestazioni quali xeroftalmia, cheratocongiuntivite secca, episclerite o sclerite, il paziente riferisce sensazione di corpo estraneo, fotofobia, lacrimazione. Queste possono verificarsi o in relazione ad una vasculite correlata a positività al fattore reumatoide, oppure in relazione a una contemporanea connettivite quale ad esempio la sindrome di Sjogren.
RENE: solitamente tale distretto viene coinvolto con la comparsa di nefrite in merito ad associazione con amiloidosi oppure in merito a consumo cronico di farmaci assunti per controllare la stessa AR, quale ad esempio lo sviluppo di nefrite interstiziale per abuso di FANS.
La diagnosi viene formulata con anamnesi (dolore articolare continuo e rigidità esarcebata al mattino e della durata superiore ad un’ora), esame obiettivo (vari segni). Viene confermata mediante laboratorio ed esame strumentale.
Il laboratorio prevede i seguenti dati:
1- Anemia normocromica e normocitica, quasi sempre presente e talvolta anche di tipo ipocromico.
2- Elevazione degli indici di flogosi
3- Positività del siero per il fattore reumatoide e per gli anticorpi anti peptidi-citrullinati.
La positività del fattore reumatoide è poco specifica per malattia in quanto può essere positivo anche in patologie quail Sindrome di Sjogren, Lupus, malattie ematologiche, infezioni batteriche, sarcoidosi, sclerodermia, infezione da virus epatitoc C, eccetera. Al contrario, gli anticorpi rivolti contro i peptidi citrullinati hanno una specificità superiore al 90%.
L’esame strumentale precoce si avvale dell’utilizzo della TAC e della risonanza magnetica con gadolinio, i quali permetteranno di individuare la presenza di uno stato infiammatorio con versamento articolare, proliferazione sinoviale a formare radio graficamente un vero e proprio “panno” che va a occludere lo spazio interarticolare, la presenza di angiogenesi cartilaginea e sinoviale, nonché la presenza di edema canalicolare osseo con possibile erosione dell’osso sottocondrale. Alla radiografia in fase avanzata sarà osservabile la presenza di erosione ossea superficiale con margini irregolari, a “morso di topo”.
L’erosione a morso di topo è dovuta ad uno squilibrio fra fattori osteoclastici e fattori osteoblastici. In particolare il fattore RANK-L attivante gli osteoclasti viene secreto da linfociti T e fibroblasti attivati, specialmente in risposta ad elevati livelli di IL-1, e dunque il fattore RANKL va a turbare l’equilibrio provocando l’insufficienza di altri fattori favorenti la produzione e la deposizione di matrice ossea, quali ad esempio la osteoprotegerina.
Il fattore reumatoide (FR) è un autoanticorpo (anticorpo diretto contro i tessuti propri di un organismo), molto rilevante nell'artrite reumatoide. In particolare, è diretto verso la porzione Fc delle IgG. Il fattore reumatoide e le IgG concorrono alla formazione di immunocomplessi in grado di contribuire al processo patologico. Non tutti i soggetti con artrite reumatoide possiedono livelli sierici rilevabili di fattore reumatoide; tuttavia, questi soggetti, non sono da considerare sieronegativi. Il fattore reumatoide è anche una crioglobulina (anticorpo che precipita dopo raffreddamento di un campione ematico); può essere sia una crioglobulina tipo di tipo 2 (IgM monoclonale contro IgG policlonali) sia crioglobulina di tipo 3 (IgM policlonale contro IgG policlonale). La determinazione del fattore reumatoide deve avvenire in tutti i pazienti nei quali si ha rilievo clinico di artrite. È importante considerare che un rilievo positivo non indica necessariamente artrite reumatoide e che, viceversa, un rilievo negativo non la esclude. Tuttavia, assume notevole importanza diagnostica e prognostica se associato all'obiettività di altri rilievi tipici dell'artrite reumatoide. Alti livelli di FR (generalmente sopra a 20 IU/mL) sono indicativi per l'artrite reumatoide (presente nell'80% dei casi) e per la Sindrome di Sjögren (presente in almeno il 100% dei casi). Inoltre, c'è una connessione tra i livelli di FR e la gravità della malattia. C'è una buona possibilità di incorrere in falsi positivi, dovuti alla presenza di alcune malattie o di disordini autoimmuni. Queste includono: epatiti croniche, infezioni virali croniche, leucemia, dermatomiosite, mononucleosi, sclerodermia, tiroidite di Hashimoto e lupus eritematoso sistemico.
Tre nomi spesso incontrati nello studio dei passaggi chiave dell'attivazione del sistema immunitario. Tre nomi che hanno fatto, fra i tanti, la storia della medicina e che vengono insigniti per questo del premio nobel 2011. Premio purtroppo postumo per uno di loro, lo scienziato canadese Ralph Steinman morto tre giorni fa e vincitore del premio per la medicina 2011 insieme con l'americano Bruce Beutler e al lussemburghese Jules Hoffmann. "Steinman - si legge in un comunicato Rockefeller University, dove lavorava - è deceduto il 30 settembre. Quattro anni fa, gli era stato diagnosticato un carcinoma al pancreas. Il ricercatore è riuscito ad allungare il decorso della malattia grazie all'immunoterapia basata sulle cellule dendritiche". Proprio le nuove scoperte sulle cellule dendritiche sono valse a Steinman l'importante riconoscimento di Stoccolma, pur se post mortem.
I suoi lavori, uniti a quelli degli altri due premiati, hanno aperto la strada a una nuova serie dei cosiddetti "vaccini terapeutici" contro il cancro. Le loro ricerche hanno contribuito anche a comprendere meglio il funzionamento del sistema immunitario di fronte a patologie infiammatorie quali l'artrite reumatoide. "Hanno rivoluzionato la nostra comprensione del sistema immunitario scoprendo i principi chiave per la sua attivazione", si legge in una nota del Karolinska Institutet di Stoccolma che assegna il premio.
Beutler, 54 anni, lavora nell'istituto Scripps ed è stato premiato con Hoffmann, 70 anni, per avere scoperto le proteine dei recettori che attivano l'immunità innata, il primo meccanismo del nostro sistema di difesa. Steinman era ricercatore presso la Rockefeller University ed è stato premiato per aver osservato per primo le cellule dendritiche che regolano l'immunità adattativa, la fase successiva della risposta di difesa durante la quale i microrganismi vengono cancellati dal corpo.
Jules Hoffmann ha compiuto la sua scoperta pionieristica nel 1996, quando con i suoi collaboratori si è concentrato sullo studio dei moscerini della frutta e del modo in cui combattono le infezioni. Il team ha analizzato insetti con mutazioni a livello di numerosi geni tra cui il "Toll". Infettando i moscerini con batteri o funghi, Hoffmann scoprì che i Toll mutanti morivano perchè non erano in grado di scatenare una difesa efficace.
Bruce Beutler era invece alla ricerca del recettore che si lega al lipopolisaccaride (Lps), l'involucro esterno dei batteri, causando shock settico. Nel 1998, Beutler e i suoi colleghi hanno scoperto che i topi resistenti al Lps avevano una mutazione in un gene molto simile a quella del gene Toll nei moscerini della frutta. Il recettore simil-Toll (Tlr) si è rivelata la chiave.
"Un premio meritatissimo a tre scienziati che hanno dato un contributo essenziale allo sviluppo dell'immunologia", commenta Piergiuseppe De Berardinis, primo ricercatore all'Istituto di Biochimica delle proteine del Cnr di Napoli, che aggiunge: "Le scoperte sulle cellule dendritiche sono fondamentali per gli studi sull'immunoterapia dei tumori e nelle terapie farmacologiche sperimentali per la cura del cancro, in quanto definiscono i meccanismi di risposta immediata e a lungo termine del sistema immunitario nei confronti degli agenti patogeni". FONTE: Repubblica.it
Scoperto da Gorer nel 1936 su studi effettuati in topi non singenici in cui venivano effettuati trapianti di tumore: solo i tumori singenici attecchivano e uccidevano le cavie (topi inbred). L’MHC fu poi confermato sempre in termini di istocompatibilità da Medawar su studi effettuati su cadaveri durante la seconda guerra mondiale. Infine ulteriori conferme provengono da studi effettuati su decessi di individui politrasfusi e donne multigravide in cui venivano espressi anticorpi rivolti verso leucociti del donatore. Inizialmente nei primi esperimenti Gorer formulò l’ipotesi che l’MHC fosse costituito da geni che si attivavano per la resistenza ai tumori. Nel 1933 Haldane scoprì che la risposta immunitaria era rivolta verso gli antigeni tissutali (e non tumorali). Nel 1948 Snell effettuò su topi “quasi singenici” (diversi solo nel cromosoma 17 che nel topo è quello che porta l’MHC) studi che permisero di identificare i loci del complesso H2, la quale ha una organizzazione analoga a quella nell’uomo. Nel topo H2-L, H2-K, H2-D (classe I), H2A e H2E (classe 2).
All’inizio degli anni 1960 Dausset osservò che pazienti che rigettavano trapianti avevano reazioni immunitarie trasfusionali contro i linfociti del donatore dell’organo, Venne introdotto il concetto di alloantisiero, cioè di un siero con anticorpi che riconoscono allo antigeni. La ricerca si indirizzò verso lo studio dei geni responsabili di tale fenomeno usando il siero di soggetti politrasfusi, trapiantati, multigravide, ect. Nel 1970 Zinkelnagel e Doherty scoprirono il fenomeno del riconoscimento con restrizione da MHC.
Complesso HLA => Braccio corto del Cr. 6 da 6p21.1 a 6p21.3, 3500 coppie di basi, circa 50 fra geni e pseudogeni
La regione MHC è lunga 2-3 centimorgan, circa 4 milioni di paia di basi, e vi sono circa 100 geni. Vi sono 3 geni MHC di classe I, e 8 geni di classe 2.
CLASSE 1 (più vicina all’estremità) => Catena α di eterodimeri α/β – 6 locus genici (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-5.4, HLA-6.0). Catena α di 44.000 Dalton, Catena β di 11.500 Dalton non polimorfica e codificata da un gene sul Cr. 15
CLASSE 2 (più vicina al centromero) => Catena α/β degli eterodimeri α/β – 1 locus genico (HLA-D) suddivisa in sottoclassi (DN, DP, DZ, DO, DQ, DR), i prodotti sono definiti anche come Antigeni IA (cioè antigeni della risposta immunitaria)
CLASSE 3 (intermedia fra le due classi) => Presenta dei geni che producono particelle solubili quali ad esempio i fattori cel complemento C4A, C4B, C2, B, la 21 idrossilasi per gli steroidi, i geni per il TNFα/β, eccetera
Varianti alleliche:
HLA-A ha 59 alleli,
HLA-B ha 111 alleli,
HLA-C ha 37 alleli.
HLA-DP ha 8 alleli per la catena α e 62 alleli per la catena β.
HLA-DQ ha 16 alleli per la catena α e 25 per la catena β.
HLA-DR ha 1 allele soltanto per la catena α e 122 alleli per la catena β.
MOLECOLE DI CLASSE 1: sono glicoproteine di membrana caratterizzate da un esteso polimorfismo e dalla capacità di presentare antigeni di natura endogena. Sono degli eterodimeri α/β in cui la catena alfa di 44.000 Dalton è codificata dai geni del Cr.6 e la catena beta di 15.500 Dalton è codificata da un gene sul cromosoma 15 e non è polimorfa. Le due catene sono legate mediante ponte disolfuro e nella catena alfa si ha un ulteriore ponte disolfuro intracatenario. La catena β è non polimorfa e non glicosilata, assume il nome di β2-microglobulina. Nell’insieme la molecola è composta da quattro domini ognuno composto da circa 90 amminoacidi e ripartiti come α1, α2, α3 e β1. Nell’analisi cristallografica della struttura tridimensionale si osserva come α1 e α2 partecipano alla formazione di una tasca molecolare impegnando circa 50 amminoacidi nella formazione di 2 gruppi di 8 foglietti β-planare ad andamento antiparallelo e di circa 35 amminoacidi impegnati a formare due segmenti α-elica che formano le pareti della tasca. I domini α3 e β1 sono altamente conservati e reggono questa struttura in cui viene riconosciuto il peptide immunogeno. Tutte le cellule esprimono molecole di classe I, alcuni tipi come i fibroblasti, le cellule muscolari, le cellule nervose li esprimono in quantità ridotta. I linfociti T sembrano esprimere soprattutto HLA-E.
La regione genomica di classe 1 risulta essere localizzata in vicinanza dell’estremità telomerica e presenta 6 locus in cui sono presenti geni completi e codificanti (HLA-A, HLA-B, HLA-C detti questi “geni classici” e inoltre HLA-5.4, HLA-6.0 e HLA-E) e un certo numero di pseudogeni (circa 11 nella linea linfocitaria 721 come riportato a titolo di esempio dal testo).
L’importanza della variabilità concentrata nei domini α1 e α2 è stata confermata da esperimenti di “Exon Shuffling” in cui erano costruiti dei geni ibridi che venivano in seguito trasfettati in cellule che non esprimevano tali geni in modo costitutivo e in seguito veniva effettuata una analisi degli epitopi polimorfi mediante anticorpi monoclonali allogenici ottenendo così informazioni relative alla localizzazione e alle distanze relative fra i determinanti. Mediante l’applicazione di tecniche di mutagenesi diretta contro siti specifici e paragonando le sequenze amminoacidiche di differenti alleli è stato possibile individuare almeno 3 zone di ipervariabilità quali:
1) da 62 a 83 (in α1)
2) da 105 a 116 (in α2)
3) da 117 a 194 (in α2 e α3)
questo perché la gran parte dei mutanti contiene delle sostituzioni multiple sempre raggruppate in determinate zone delle sequenze. Gli alleli differiscono principalmente per i domini α1 e α2. Grazie a meccanismi di diversificazione genetica quali la conversione genica (trasferimento di informazione da un gene minore a un gene di un locus principale) e la mutagenesi esistono altre 100 alleli per i locus di MHC1 e ogni allele, specificato con un numero che segue la lettera, caratterizza l’istotipo dell’individuo. Due forme alleliche dello stesso gene sono sempre co-espresse (Alleli codominanti).
Per quanto riguarda la regolazione dell’espressione dei geni MHC1 una alterazione dei meccanismi di regolazione può determinare una iperespressione così come avviene ad esempio nelle cellule neoplastiche. Per meccanismi regolatori si considerano:
1) Una cis-regolazione che viene attuata mediante la presenza di sequenze di DNA localizzate all’estremità 5’ del gene regolato quali ad esempio la sequenza promotrice “TATA Box” alla distanza di 50 paia di basi dal CAP 5’ o la sequenza “CAAT BOX” localizzata alla distanza di 25 bp. O anche sequenze promotrici tessuto specifiche leggermente differenti da quelle citata (ad esempio vedasi la condizione della HLA-C che solitamente è meno espresso rispetto a tutti gli altri locus)
2) Una transregolazione che viene attuata mediante codifica di fattori molecolari da geni distinti. Questo meccanismo è dimostrato sperimentalmente dal risultato di una fusione di due linee cellulari linfoidi di cui una linea T non esprimente MHC e una linea B normale. E’ inoltre dimostrata dalla variazione positiva che si verifica sul mezzo di coltura per liberazione di molecole quali IFN- α, IFN- β, IFN-γ, che causano un aumento di trascrizione per modulazione della stabilità dell’RNA messaggero.
3) Una transregolazione posttrascrizionale che è stata dimostrata con un esperimento di mutagenesi con raggi gamma in una cellula linfoide e successiva reintroduzione del gene 5 e con esperimenti di trasformazione cellulare mediante adenovirus oncogeno umano che riduce la stabilità dell’RNA messaggero.
La nomenclatura utilizzata per designare i geni e gli alleli di classe 1 è stata decisa nel corso del 10° congresso Workshop internazionale di Istocompatibilità.
L’ipotesi che alla base del polimorfismo allelico vi siano meccanismi di conversione genica è stata confermata da ricerche nel genoma di pseudogeni di sequenze omologhe mediante sonde sintetiche di oligonucleotidi complementari alle sequenze mutate.
La conversione riguarda un quantitativo di basi da 5 a circa 100. Le tecniche di mutagenesi diretta contro siti specifici delle molecole MHC-1 associate con l’analisi delle sequenze amminoacidiche coinvolte nel riconoscimento da parte della cellula linfocitaria CD8 CTL ha fornito un modo preciso per analizzare la struttura e le funzioni di queste molecole. E’ stato osservato come la mutazione indotta in un sito di glicosilazione determina mancato legame del carboidrato corrispondente e della β2-microglobulina con mancata espressione di MHC1 nelle membrane. Alterazioni apportate da 152 a 156 causano mancato riconoscimento del peptide immunogeno da parte delle cellule CTL.
MOLECOLE DI CLASSE 2: tali glicoproteine sono espresse in modo costitutivo su di un ristretto numero di tipi cellulari quali le cellule APC principalmente, i linfociti B periferici, le cellule di Langherans della cute, le cellule dell’epitelio timico, i macrofagi. Sono inoltre espresse nella maggior parte dei precursori delle linee maturative ematopoietiche ma non sono espressi negli eritrociti, nei granulociti o nelle plasmacellule. Le molecole MHC-2 sono eterodimeri α/β in cui la catena α di 33.000 dalton è costituita da due domini e la catena β di 28000 dalton è costituita da due domini, le due catene sono reciprocamente legate da ponte disolfuro, nel citoplasma le due catene sono associate in modo temporaneo a un peptide γ Gamma. I geni di MHC-2 sono costituiti da un solo locus genico HLA-D in cui si distinguono delle sottoclassi in cui i principali sono
1) HLA-DP (distinto allelicamente in DPA1 e DPB1)
2) HLA-DR (distinto allelicamente in DRA, DRB1, DRB3, DRB4.
L’estensione del locus D è di 1100 Kilobasi quasi il doppio dell’omologo murino H-2I. Nell’uomo si hanno inoltre sottolocus HLA-DQ, HLA-DP, HLA-DO, HLA-DN, HLA-DZ.
L’organizzazione della regione MHC-2 è stata definita grazie alle tecniche di mappatura dei cloni genomici in vettori cosmidici o fagici, tuttavia mentre nel DNA di topo tale operazione era facilitata dalle modeste dimensioni, nell’uomo i gruppi di geni erano troppo distanti fra loro a causa della presenza di sequenze ripetute.
Nel genoma di topo si è osservato come le copie per α e β di un singolo gene erano ravvicinante e con una estremità 3’ che era prospiciente, conferendo una disposizione “Tail-to-Tail” che si manteneva anche nell’uomo ad eccezione delle copie del sottolocus DP in cui si aveva una disposizione prospiciente del 5’ “head-to-head”. Mediante tecniche di PGFE e di Southern Blot è stato possibile osservare come i geni di tale locus sono più numerosi delle catene polipeptidiche che scaturiscono dal MHC-2.
Un gene per la catena α contiene 5 esoni quali un dominio segnale, un dominio per α1, un dominio per il dominio idrofobico e un dominio per il dominio intracitoplasmatico, e infine un dominio per parte della regione 3’ non tradotta.
Un gene per la catena β ne contiene 6 (il dominio per il citoplasma è codificato da 2 esoni anziché un solo esone).
Nell’ambito di un gene il dominio più conservato è il terzo esone, la variabilità si concentra in α1 e β2 cioè nel secondo esone. In questo dominio si riscontrano 3 o 4 sequenze ipervariabili. Anche in questo caso si considerano come fonte di variabilità 1) la conversione genica 2) la mutazione puntiforme 3) lo splicing alternativo. E’ stata inoltre scoperta un’elevata frequenza di ricombinazione dovuta alle presenza di un sito genetico “hot spot “ fra i geni della subregione DP e i geni di DQ e DR (fra questi invece vi è una scarsa frequenza di ricombinazione). Lo studio dei geni a livello dei differenti alleli permette di raggruppare alleli simili e costruire alberi evoluzionistici in cui è stato possibile osservare per alcune varianti alleliche di DP e DQ un certo fenomeno di “Linkage Disequilibrium” cioè una associazione preferenziale di determinati alleli nel cromosoma 6.
Riguardo le catene α, i geni meno polimorfi sono il DRα e il suo omologo Eα nel topo, i geni più polimorfi sono il DQα1 e il suo omologo murino Aα.
I geni meno polimorfi riguardo le catene β sono il Doβ nell’uomo e i geni Aβ2 e Eβ2 nel topo.
Le molecole MHC-2 possono essere indotte in elementi cellulari trattati con IFN-Gamma o in cellule neoplastiche. I linfociti T umani possono esprimere MHC-2 in caso di trattamento con mitogeni o in caso di reazione mista leucocitaria in colture (Reazione CML). L’IFN-gamma non è in grado di indurre un aumento di esposizione del MHC-2 se il gene considerato è del sottogruppo DQ. E’ opportuno specificare la differenza fra APC professioniste e non professioniste. Riguardo altri fattori che influenzano il livello di MHC-2 esposto il IL-5 aumenta tale esposizione nei linfociti B a riposo, la prostaglandina PGE riduce l’esposizione nei macrofagi.
Si è osservato che il trattamento con IFN-Gamma determina una maggiore sensibilità della cromatina agli enzimi DNAasi poiché probabilmente si ha una variazione del livello di metilazione che causa il variare dell’esposizione di MHC-2.
Riguardo la regolazione genica, si osserva nei geni codificanti le catene β la presenza delle sequenze promotrici CAAT e TATA, la catene α non le presentano. Inoltre nel confronto fra le sequenze dei due geni si è osservata la presenza di due sequenze non polimorfiche denominate sequenza X e sequenza Y, costituita da 10 e da 14 paia di basi e distanziate reciprocamente da 20 paia di basi in un gene e da 18 paia di basi nell’altro. Queste sequenze sono localizzate a -110 a.a. e da -69 a.a. dal sito di inizio 5’ e sono coinvolte in un meccanismo comune di regolazione della espressione. E’ stata inoltre trovata un’ulteriore sequenza a 600 paia di basi dal 5’ del gene DRA e che causerebbe un aumento correlato all’uso di IFN-Gamma. Questa sequenza sarebbe presente anche a monte di HLA-A3.
Il ruolo di queste sequenze è stato esaminato mediante esprimenti di trasfezione usando dei geni DQB1 deleti nelle propria sequenze fiancheggianti il codice, questi geni sarebbero poi stati trasfettati in fibroblasti e si sarebbe valutata la loro espressione nella cellula in differenti condizioni. Una delezione a monte di 5’cap comporta un aumento della trascrizione (per cui X e Y regolerebbero in modo inibitorio) ma anche una ridotta produzione delle catene e quindi una ridotta esposizione. Delezioni a valle del gene fanno perdere l’inducibilità da IFN-Gamma.
L’esistenza di diverse sequenze fiancheggianti il 5’ presuppone la possibilità di una regolazione basata su fattori prodotti da altri geni e quindi agenti in trans. Tale teoria è stata confermata in alcuni pazienti affetti da SCID in cui i linfociti presentarono una assenza di espressione di DP, DQ, DR, e in tali famiglia il difetto non segregava con il cromosoma 6, ma una riespressione era ottenibile sperimentalmente per fusione di un linfocita SCID con una linea linfocitaria B IA+.
Un ulteriore esperimento ha confermato che la creazione di un ibrido cellulare fra una cellula umana e una cellula murina splenica e la successiva analisi della secrezione di marcatori mostra un fattore “AIR-1” e presente nelle cellule B di topo e che agisce positivamente in trans sulla espressione di MHC-2. Altri fattori agenti in trans sarebbero necessari per l’attività delle linfochine. Mediante esperimenti di attività di legame in estratti cellulari è stato individuato un fattore nucleare che si lega a un ottametro posto a 500 paia di basi e dotato di sequenza “ATTTGTAT”.
Durante la maturazione delle catene nel citoplasma all’eterodimero si associa una catena “γ gamma” P33 codificato da un gene localizzato sul cromosoma 5 e che interviene ancorando la glicoproteina α/β nella membrana del RER. Si è ipotizzato che tale catena sia invertita cioè con una estremità carbossilica posta verso l’esterno della membrana. Essa si stacca prima dell’espressione di α/β. Il gene che codifica questa molecola non è polimorfo e possiede sequenze X e Y al 5’cap.
Le catene dell’eterodimero si associano quasi sempre rispettando il proprio isotipo e nell’ambito dell’isotipo le catene si associano in modo indipendente dall’aplotipo (es una Aα che proviene dal gene DR con una Bα che proviene da DR).. Le molecole dello stesso isotipo si associano grazie al riconoscimento reciproco attuato dai domini non polimorfi. MHC-2 ibride (es. DPA1 con DRB1) sono molto rare e quasi sempre no nvengono espresse. L’associazione può anche essere transallelica (es. Dq1A / Dq7B) anche se l’associazione interalleica è poco rilevante nell’aumentare il polimorfismo.
Esperimenti di “Exon Shuffling” e di Mutagenesi hanno dimostrato come α1 partecipa al legame con l’antigene, β1 è la sede del sito di legame con il TCR del linfocita T.
La β2-microglobulina è composta da circa 100 amminoacidi. Nel MHC-1 le due α-elica della struttura si avvicinano molto e chiudono la tasca. Nel MHC-2 invece le due eliche sono un po’ più distanti e la tasca accoglie frammenti più lunghi (fino a 20 a.a.). Nel MHC-2 i residui terminali hanno minore importanza nel legare il frammento perché la tasca è aperta.
Il recettore dei linfociti T prende il nome di recettore TCR-CD3. Questa molecola è costituita dall’associazione di 2 molecole (7 catene) transmembrana quali il Ti α-β e il CD3.
Il Ti α-β è costituito da una coppia α-β al 95% o da una coppia di catene γ-δ al 5%. Entrambi sono degli eterodimeri clonotipici dal peso molecolare di 90000 Dalton. Queste molecole sono costituite da una parte variabile extracellulare e una parte costante intracellulare e per tale motivo hanno una struttura tipica delle superfamiglia di immunoglobuline. La catena α (o la gamma) si lega all’epitopo dell’antigene. La catena β (o la delta) si lega alla molecola MHC che presenta l’antigene.
La catena α presenta un peso molecolare di 45000 Dalton, è codificata da un locus genico localizzato nel cromosoma 14 in posizione 14q11-12, possiede un singolo gene che trascrive la regione costante e circa 100 geni che codificano la regione variabile, di questi si ha una ripartizione fra segmenti genici V e J (circa 25) mentre non vi sarebbero segmenti D. Attraverso il riarrangiamento C-J-V si ottengono catene α clonospecifiche.
La catena β presenta un p.m. di 55000 Dalton, è codificata da un locus genico localizzato nel cromosoma 7 in posizione 7q35 in cui si osservano due segmenti genici D-J-C. disposti a tandem e all’estremità 5’ si osservano circa 50 geni V. Attraverso il riarrangiamento C-J-D-V si ottiene la clonospecificità per le catene MHC presentanti l’antigene.
L’eterodimero γ-δ possiede la stessa organizzazione nello sviluppo del timociti esso appare prima di α-β e viene esposto nella cellula solo se produttivo. Le cellule trasportanti tale dimero pattugliano gli epiteli e hanno generalmente attività citotossica antineoplastica e sollecitano lo sviluppo dei timociti.
Il CD3 è formato dall’associazione di 5 catene quali γ (gamma di 25 kda), δ (delta di 20 kda), ε (epsilon di 20 kda), η (ni) e ζ (zed di 16 kda). Il legame fra CD3 e TCR è di tipo ionico. γ e δ sono ricchi di serine, ζ è invece ricco di tirosine che se fosforilate permettono la trasmissione del segnale di attivazione.
Il recettore dei linfociti T prende il nome di recettore TCR-CD3. Questa molecola è costituita dall’associazione di 2 molecole (7 catene) transmembrana quali il Ti α-β e il CD3.
Il Ti α-β è costituito da una coppia α-β al 95% o da una coppia di catene γ-δ al 5%. Entrambi sono degli eterodimeri clonotipici dal peso molecolare di 90000 Dalton. Queste molecole sono costituite da una parte variabile extracellulare e una parte costante intracellulare e per tale motivo hanno una struttura tipica delle superfamiglia di immunoglobuline. La catena α (o la gamma) si lega all’epitopo dell’antigene. La catena β (o la delta) si lega alla molecola MHC che presenta l’antigene.
La catena α presenta un peso molecolare di 45000 Dalton, è codificata da un locus genico localizzato nel cromosoma 14 in posizione 14q11-12, possiede un singolo gene che trascrive la regione costante e circa 100 geni che codificano la regione variabile, di questi si ha una ripartizione fra segmenti genici V e J (circa 25) mentre non vi sarebbero segmenti D. Attraverso il riarrangiamento C-J-V si ottengono catene α clonospecifiche.
La catena β presenta un p.m. di 55000 Dalton, è codificata da un locus genico localizzato nel cromosoma 7 in posizione 7q35 in cui si osservano due segmenti genici D-J-C. disposti a tandem e all’estremità 5’ si osservano circa 50 geni V. Attraverso il riarrangiamento C-J-D-V si ottiene la clonospecificità per le catene MHC presentanti l’antigene.
L’eterodimero γ-δ possiede la stessa organizzazione nello sviluppo del timociti esso appare prima di α-β e viene esposto nella cellula solo se produttivo. Le cellule trasportanti tale dimero pattugliano gli epiteli e hanno generalmente attività citotossica antineoplastica e sollecitano lo sviluppo dei timociti.
Il CD3 è formato dall’associazione di 5 catene quali γ (gamma di 25 kda), δ (delta di 20 kda), ε (epsilon di 20 kda), η (ni) e ζ (zed di 16 kda). Il legame fra CD3 e TCR è di tipo ionico. γ e δ sono ricchi di serine, ζ è invece ricco di tirosine che se fosforilate permettono la trasmissione del segnale di attivazione.
Riassuntiva rassegna delle tecniche immunodiagnostiche più comunemente utilizzate in ambito immunologico. Per informazioni più precise consultare dei libri di testo quale l'Abbas o il Janeway o l'antichissimo ma sempre attuale Miserafi-Jirillo (che hanno fatto un pò da fonti ufficiali per scrivere questo post). Buona lettura.
1) DIALISI IN EQUILIBRIO: è un test utilizzato per determinare i valori di affinità fra un anticorpo e un antigene di piccole dimensioni (es: aptene) che può oltrepassare una barriera di dialisi. Con questo metodo si determina l’equilibrio delle concentrazioni dell’antigene legato e libero, a concentrazioni costanti di anticorpo. L’antigene viene fatto equilibrare fra due camere di cui una camera B contenente l’anticorpo che non può penetrare nella camera A laddove è contenuto l’antigene, mentre al contrario l’antigene contenuto nella camera A può superare la barriera e penetrare nella camera B legandosi all’anticorpo. Dopo un certo periodo sufficiente affinché si raggiunga l’equilibrio si potrà calcolare la quota di antigene legata all’anticorpo che risulta calcolata usando la differenza tra la concentrazione degli antigeni nelle due camere mentre la concentrazione libera di antigene è rappresentata dalla quantità di molecole antigeniche rimanenti nella camera A.
2) REAZIONE DI PRECIPITAZIONE: è una tecnica che utilizza la formazione di sedimento in una piastra su cui si dispone un substrato il quale corrisponde solitamente all’agarosio e in cui si scavano mediante punzone delle cavità (pozzetti di Petri). Questa tecnica si basa sulla creazione di precipitato visibile che si forma nella formazione di immunocomplessi per incontro fra antigene e anticorpo specifico per l’antigene esaminato. E’ stata la prima tecnica usata per verificare la produzione di anticorpi e per il dosaggio di Immunoglobuline ma la sua applicazione è attualmente molto ridotta e viene usata per misurare una quantità di anticorpo (in relazione a una quantità fissa di antigene) o per verificare la valenza di un antigene. Esistono due tipi di reazione di precipitazione in agarosio quali la diffusione semplice di Mancini – Carbonara – Heremans e la diffusione doppia di Outcherlony.
3) REAZIONE DI PRECIPITAZIONE SEMPLICE DI MANCINI-CARBONARA-HEREMANS: è una tecnica utilizzata per il dosaggio semiquantitativo delle immunoglobuline e dei fattori del complemento. Su di una piastra si pone l’agarosio miscelato ad anticorpi e si scavano nella piastra dei pozzetti periferici in cui si pongono gli antigeni da esaminare. Se per esempio si vogliono dosare le IgG seriche di un individuo, si effettua un prelievo di siero e in una piastra già contenente antisiero anti-IgG (cioè un siero presentante immunoglobuline espresse contro le IgG) si depositano nei pozzetti periferici delle quantità a concentrazione nota (standard) di IgG e in pozzetti contigui il siero in esame. La reazione fra antigene e anticorpo comporterà la formazione di precipitato di forma anulare attorno ai pozzetti. Misurando il diametro del pozzetto per mezzo di un oculare millimetrato e confrontandolo con la scala di taratura riferita per gli standard quantitativi si potrà risalire alla concentrazione di IgG del campione in milligrammi%.
4) REAZIONE DI PRECIPITAZIONE DOPPIA DI OUTCHERLONY: è una tecnica utilizzata per definire se due o più antigeni sono identici o simili e se possono reagire con l’anticorpo utilizzato. Su di una piastra di agarosio sono scavati una corona di pozzetti periferici e un pozzetto centrale. Nei pozzetti periferici viene posto l’antigene o gli antigeni in esame, mentre nel pozzetto centrale è posto l’anticorpo. Quando l’antigene e l’anticorpo si incontrano formano lungo la linea di incontro una banda di precipitazione visibile mascoscopicamente e abbastanza lineare. Se in due pozzetti contigui periferici si depongono due antigeni del tutto identici si avrà due linee di precipitazione inosculate fra loro (reazione di identità). Al contrario se gli antigeni sono dissimili i due archi di precipitazione si incroceranno a X (reazione di non-identità). Infine, se l’identità è parziale si avrà la formazione di un prolungamento dei segmenti (reazione di semi-identità).
5) IMMUNOELETTROFORESI: è una tecnica molto utilizzata per la diagnosi sierologica di paraproteinemia in individui con Mieloma Multiplo (IgG, IgA, IgD e IgE) o affetti da Macroglobulineamia di Walderstrom (IgM). La paraproteina è morfologicamente deformata per cui reagisce con una sola delle due catene leggere presenti nel siero (o la kappa o la lambda). La IEF si basa su due principi quali la capacità delle proteine di migrare se poste all’interno di un campo elettrico e la precipitazione fornita per incontro della proteina antigenica con la proteine anticorpale. Su di una striscia di acetato (o nitrato) di cellulosa oppure all’interno di un pozzetto scavato in un piastra coperta da agarosio, si pone una goccia di siero umano da analizzare e quindi tale striscia o piastra verrà sottoposta a un campo elettrico e infine si pone l’antisiero per provocare la precipitazione. Avvenuta la reazione si identifica la banda delle albumine posta vicino all’anodo e la banda più lenta delle gammaglobuline posta vicina al catodo.
6) REAZIONE DI EMOAGGLUTINAZIONE: è una tecnica che prevede la formazione di un immunocomplesso in cui l’antigene è di tipo corpuscolato quale ad esempio un eritrocita. Utilizzando una reazione con emazie di montone e IgM emolisine si osserva sul fondo dei pozzetti della piastra dei piccoli bottoncini colorati corrispondenti alle emazie intrappolate nella rete formata dalle IgM. Una variante è la Emoagglutinazione Passiva in cui l’antigene viene associate alle emazie le quali sono utilizzate come un sistema rivelatore. Tale variante può servire per svelare la presenza nel siero di anticorpi espressi nei confronti di batteri, funghi, protozoi o virus copulati con le emazie. Questo test è usato anche per determinare rapidamente il gruppo sanguigno di un paziente donatore o ricevente sangue AB0: si ha l’agglutinazione a causa dell’espressione di anticorpi anti-A o anti-B. La reazione dimostra che ogni immunoglobulina presenta almeno due siti identici per legare l’antigene poiché durante questa aggregazione si ha un cross-linking delle cellule del sangue a causa del legame simultaneo di anticorpi e antigeni identici presenti su cellule differenti.
7) REAZIONE DI EMOLISI PASSIVA: è una tecnica che utilizza lo stesso principio della emoagglutinazione, prevede l’aggiunta al sistema di fattori del complemento, si ha cioè una fissazione del complemento (o deviazione del complemento) che, attivandosi a causa della formazione dei complessi antigene-anticorpo, provoca la lisi degli eritrociti utilizzati per marcare l’antigene considerato nella reazione.
8) TEST DI COOMBS: è una tecnica scoperta e sviluppata da Robert Coombs e utilizzata per la diagnosi di incompatibilità materno-fetale del fattore Rh (Fattore Rhesus). Questa reazione si verifica quando la madre possiede globuli rossi Rh- mentre il feto possiede globuli rossi Rh+ a causa del gene ereditato dal padre. La prima gravidanza comporta la penetrazione in circolo dei globuli rossi del feto e l’espressione di antigeni verso il fattore Rh+ del feto da parte delle plasmacellule della donna gravida, tuttavia solitamente la prima gravidanza viene portata a termine prima che gli anticorpi espressi possano causare danni al feto. La seconda gravidanza comporta la penetrazione di eritrociti e l’immediata reazione immunitaria da parte del sistema immunitario materno già sensibilizzato da cui si ha una lisi dei globuli rossi del feto (Eritroblastosi fetale) e danni che vanno dall’ittero emolitico alla morte per idrope o anasarca fetale. Esistono due tipi di Test di Coombs: diretto e indiretto. Il test diretto è una reazione in cui i costituenti sono rappresentati dalle emazie fetali e da un antisiero anti-gamma globuline che provocherà l’agglutinazione del sistema, è chiamato diretto poiché si pone in evidenza direttamente gli anticorpi legati alla superficie degli eritrociti. Nel test indiretto il siero della madre è incubato in presenza di globuli rossi Rh+ ai quali si aggiunge in seguito l’antisiero anti-gammaglobuline umano. L’agglutinazione svelerà nel siero materno la presenza di IgG anti emazie Rh. Le IgG anti Rh non fissano il complemento ma in vitro possono causare lisi cellulare. Normalmente le IgG materne penetrano nel feto attraverso la placenta per fornire protezione. Il test di Coombs è stato di recente utilizzato anche per valutare l’eventuale attività emolitica di un farmaco verso il siero di un paziente e quindi la possibile reazione immunitaria alla somministrazione del farmaco.
9) REAZIONE IMMUNOENZIMATICA ELISA: è una tecnica che prevede l’evidenziazione dell’immunocomplesso attraverso l’aggiunta di un enzima che agisce con un substrato. ELISA è una sigla che sta per “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”. E’ una tecnica abbastanza diffusa, fu utilizzata all’origine come test di identificazione e attualmente è utilizzata per varie applicazioni fra cui il dosaggio di citochine nei liquidi biologici e per la diagnostica di virus HIV. L’avvento degli anticorpi monoclonali, con la possibilità di ottenere l’antigene e l’anticorpo altamente purificati, hanno reso la reazione immunoenzimatica più sensibile e più specifica. Il test ELISA si presta a numerose variazioni e rappresenta la tecnica sierologica più versatile.Solitamente gli enzimi usati per la reazione di evidenziazione sono la fosfatasi alcalina o la perossidasi, i cui prodotti di reazione sono visibili colorimetricamente attraverso uno spettrofotometro che ne misura la velocità di formazione. L’antigene da svelare viene coniugato a un supporto e lasciato incubare con un anticorpo specifico. A questo punto si aggiunge l’antigene noto coniugato all’enzima e infine il substrato. Se la reazione è positiva significa che l’anticorpo ha reagito con l’antigene coniugato al pozzetto e quindi il complesso antigene-enzima non avendo reagito con l’anticorpo specifico è in grado di attaccarsi al substrato e dare luogo al prodotto della reazione. Al contrario se l’antigene da svelare non reagisce con l’anticorpo, quest’ultimo si legherà all’antigene coniugato all’enzima e quindi il substrato non viene a essere fissato avendosi così una reazione negativa. Il limite di questa tecnica consiste nella impossibilità di misurare quantitativamente un anticorpo o un antigene non conosciuto ma vi è la necessità dell’uso di molecole purificate da associare all’enzima.
10) REAZIONE RADIOIMMUNOLOGICA RIA: è una tecnica che consente il dosaggio di numerose sostanze e sono di largo impiego in medicina per il dosaggio di ormoni e nel settore immunologico per la determinazione di citochine nel siero, nel plasma o nel liquor. La metodica RIA si fonda sul concetto della competizione esistente per l’anticorpo specifico fra l’antigene radiomarcato e l ‘antigene freddo. Gli anticorpi vengono solitamente marcati con isotopo di iodio radioattivo 125 I. Il limite di questa tecnica consiste nella impossibilità di misurare quantitativamente un anticorpo o un antigene non conosciuto ma vi è la necessità dell’utilizzo di molecole purificate.
Il RIST (Radio Immuno Sorbent Test) è usato per la determinazione delle IgE totali nel siero del paziente. I reagenti sono costituiti da anticorpi anti-IgE legati a palline di Sephadex (il nome commerciale di un destrano), IgE del campione e IgE standard marcate. A causa della competizione per il sito di legame, maggiore sarà la radioattivita in cpm dovuta alla fissazione delle IgE marcate al sephadex e minore sarà la concentrazione sierica delle IgE.
Il PRIST (Paper Radio Immuno Sorbent Test) si basa sulla associazione di anticorpi anti-IgE a dischetti di carta su cui si aggiungono le putative IgE contenute nel campione. Si lavano i dischetti per allontanare l’eccesso di IgE non legate e quindi si aggiunge un anticorpo anti-IgE radiomarcato. Quest’ultimo si fissa alle IgE del complesso anti-IgE-IgE e quanto maggiore sarà la radioattività tanto maggiore sarà la concentrazione delle IgE nel campione. E’ usato per il dosaggio delle IgE totali.
Il RAST (Radio Allergo Sorbent Test) è utilizzato per la ricerca di IgE specifiche nei confronti di quel determinato allergene. L’allergene in questione è copulato al sephadex e a questo si aggiunge il siero del paziente. Le IgE legatesi all’allergene sono messe in evidenza con anticorpi anti-IgE radioattivi. E’ usato per il dosaggio delle IgE specifiche.
11) METODICA DI PREPARAZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI: si fonda sulla reazione fra antigeni purificati e cellule immunocompetenti dalle quali si desiderano ottenere anticorpi specifici. La procedura fu scoperta da Kohler e Milstein, si basa sulla formazione di un ibrido cellulare derivante dalla fusione di linfociti splenici di topi immunizzati con un determinato antigene e cellule mielomatose . Queste ultime hanno capacità di replicarsi all’infinito in vitro (poiché sono cellule neoplastiche che hanno perso i fattori di controllo della replicazione cellulare), non secernono anticorpi (per scelta specifica, poiché normalmente le cellule mielomatose producono una grande quantità di anticorpi) e non possiedono l’attività di un enzima, la molecola HGPRT (Ipoxantina-Guanina-FosfoRibosil-Trasferasi). Le cellule spleniche immunizzate vengono messe a contatto con le cellule mielomatose e in presenza di glicol-polietilenico che favorisce la fusione e la formazione di ibridi cellulari. A fusione avvenuta gli ibridi vengono coltivati in terreni contenenti ipoxantina, timidina e aminopterina (un antifolico che blocca l’attività del tetraidrofolato e conseguentemente ferma la capacità di sintesi di purine e pirimidine endogene da parte delle cellule mielomatose) formando così il cosiddetto terreno HAT. Poiché le cellule mielomatose non hanno l’enzima trasferasi HPRT, non possono utilizzare la ipoxantina del terreno per produrre purine e dunque accrescere il proprio DNA se non si fondono con le cellule spleniche dotate invece degli enzimi necessari. Gli ibridomi sopravvissuti vengono clonati in singoli pozzetti di una micropiastra e i pozzetti contenenti anticorpi monoclonali vengono saggiati con metodi immunoenzimatici per determinare la specificità verso l’antigene di partenza. I pozzetti contenenti gli ibridi desiderati vengono a essere poi propagati in vivo o studiati in vitro in agar semisolido. Per ottenere anticorpi monoclonali su larga scala i cloni possono essere iniettati per via intraperitoneale in topi singenici in modo che formino asciti tumorali. Ogni ibridoma è un clone derivato dalla fusione di cellule B così tutte le molecole anticorpali che produce sono identiche nella struttura, incluso il sito di legame. Gli anticorpi monoclonali vengono attualmente usati in moltissimi saggi diagnostici, come sonde diagnostiche o come agenti terapeutici, tuttavia la stessa tecnica applicata nei mielomi umani non ha ancora dato risultati soddisfacenti.
12) TECNICA DI IMMUNOFLUORESCENZA (DIRETTA, INDIRETTA, SANDWICH): con questa tecnica gli anticorpi sono legati con legame covalente ai fluorocromi che sono sostanze dotate della proprietà di emettere, quando siano esposti a raggi ultravioletti, radiazioni della lunghezza d’onda superiore e compresa nello spettro visibile, quindi luce. I siti colorati dai fluorocromi sono resi visibili impiegando un microscopio a fluorescenza. I fluorocromi si legano facilmente alle proteine nella forma di isotiocianato. I fluorocromi più usati sono la fluoresceina (FITC) che emette una fluorescenza verde, la rodamina tetrametilata (TRITC) o la ficoeritrina (PE). E’ possibile anche usare più fluorocromi contemporaneamente. E’ opportuno specificare che il legame deve lasciare la reattività anticorpale immutata.
Nel metodo di immunofluorescenza diretta viene impiegato un anticorpo coniugato al fluorocromi e questi si lega all’antigene cellulare ricercato. Se si impiegano cellule non fissate esso può reagire solo con i determinanti di superficie della cellula. Con questa tecnica è ad esempio possibile identificare facilmente tutte le immunoglobuline espresse alla superficie di una membrana di un linfocita B. Per evitare una falsa colorazione positiva imputabile a un legame dell’anticorpo fluorescente con il recettore Fc dei linfociti è preferibile impiegare in tal caso soltanto i frammenti Fab, ottenuta dopo digestione pepsinica degli antisieri. E’ posibile mettere in evidenza antigeni citoplasmatici solo previa fissazione delle cellule, ad esempio in acetone.
Nel metodo di immunofluorescenza indiretta viene impiegato un anticorpo marcato e espresso come controanticorpo di un anticorpo che a sua volta si lega all’antigene ricercato. Il merito di questa tecnica è che viene emessa una luce più forte e quindi la determinazione sarà più precisa. E’ possibile ad esempio usare questa tecnica per individuare gli anticorpi rivolti contro antigeni di microrganismi.
Nel metodo della immunofluorescenza a sandwich si osserva una reazione che vede un antigene posto a rapporto con due anticorpi fluorescenti. Tale metodo consente di mettere chiaramente in evidenza la presenza di un antigene citofilo cioè legato a una cellula, con tale metodo si ottiene anche un modo per visualizzare i componenti complementari che si adsorbono alla superficie di una cellula.
La tecnica di immunofluorescenza può essere resa almeno 5 volte più sensibile mediante l’uso del complesso avidina-biotina che determina un incremento del numero di legami formabili fra anticorpo e antigene da visualizzare.
13) CITOFLUORIMETRIA A FLUSSO: la citofluorimetria a flusso è una tecnica analitica che consente di analizzare in maniera piuttosto precisa delle soluzioni contenenti un gran numero di elementi cellulari, quali ad esempio il sangue, o un qualsiasi tessuto non sia allo stato stazionario. Permette inoltre di ottenere informazioni relative a dati quali il volume cellulare, il numero di cellule o il numero di antigeni riscontrati.
I citofluorimetri sono degli strumenti che risultano composti un laser e da un FACS, cioè un separatore di cellule attivate in fluorescenza. Un FACS è costituito da un’apparecchiatura in cui le cellule fluorescenti sono disposte in un flusso a piccole goccioline, queste sono forzate ad attraversare un raggio laser dove la luce eccita la sostanza fluorescente che fornisce un segnale maggiore o minore in rapporto alla quantità di anticorpo legato. Le cellule vengono analizzate elettronicamente in base alla deviazione della luce che è in rapporto alla grandezza cellulare e all’intensità della fluorescenza emessa dal fluorocromi. Essere sono caricate elettricamente in un campo elettrico ad alto voltaggio e passando attraverso idonee piastre di deflessione sono separate secondo la fluorescenza posseduta dalle cellule incolori.
14) TECNICA DI IMMUNOPEROSSIDASI DIRETTA, INDIRETTA, PAP: è una tecnica che si basa sull’utilizzo di un enzima perossidasi che coniugato all’anticorpo è in grado di determinare un cambiamento del colore del campione biologico reagendo con un substrato incolore e solubile, trasformandolo in tal modo in un precipitato colorato e insolubile, visibile al microscopio. Per impedire la comparsa di falsi positivi la perossidasi endogena della cellula deve essere previamente eliminata mediante l’utilizzo di una soluzione di perossido di azoto e metanolo. I metodi possono essere diretti o indiretti oppure a tre strati (pap). E’ possibile localizzare contemporaneamente più di un antigene perché la perossidasi è capace di utilizzare più di un substrato. Per esempio è possibile individuare due molecole di natura ormonale in una sezione di tessuto tramite l’uso di due substrati quali la 3-3’-diaminobenzidina (arancione) e naftolo (blu).
15) IMMUNOMICROSCOPIA ELETTRONICA: tecnica che prevede un’analisi molto particolareggiata della struttura cellulare tramite l’utilizzo di un microscopio elettronico avente un potere di risoluzione molto elevato e tramite l’uso di coloranti che sono costituito da molecole grandi e elettrondense quali la ferritina o l’oro colloidale. Tali molecole sono legate ad anticorpi rendendo questa tecnica disponibile a mettere in evidenza praticamente qualsiasi tipo di molecola. Come solito, è possibile impiegare sia un metodo diretto che un metodo indiretto. La ferritina è una proteina di 700kD con un contenuto in ferro del 23% quindi adatta allo scopo. L’oro colloidale sono messe in evidenza al meglio mediante la precipitazione di sali di argento metallico. Usando marcatori diversi è possibile mettere in evidenza più di un antigene a causa della comparsa di una maggior elettrondensità del punto in cui avviene la precipitazione.
16) MICROLINFOCITOTOSSICITA’: è una reazione che viene impiegata per la identificazione sierologia delle specificità HLA sia di classe 1 e sia di classe 2 (soprattutto DR e DQ). Nel caso delle MHC-2 è opportuno attuare una aggiunta di colonne di nylon per permettere ai linfociti di aderire meglio. Il principio di reazione si basa sul fatto che gli allo anticorpi anti-hla sono citotossici in presenza di complemento per i linfociti che esprimono sulla membrana cellulare lo specifico antigene hla. Questo test prevede appunto una reazione che viene in seguito osservata al microscopio invertito a contrasto di fase dopo aggiunta di particolari coloranti quali esosina o trypan blue che permettono di colorare cellule non vitali. Reazioni fortemente positive si riscontrano a causa di una mortalità cellulare dall’80% fino al 100%.
17) TECNICA DI JERNE DELL’EMOLISI A PLACCHE (DIRETTA E INDIRETTA): tecnica ideata da Jerne all’inizio degli anni ’60, il quale ebbe il merito di mettere a punto una tecnica semplice e facilmente riproducibile che consente di valutare la cinetica delle risposte anticorpali a livello cellulare identificando e numerando le singole cellule che producono gli anticorpi in un determinato organo linfoide. La tecnica di Jerne è una tecnica di emolisi localizzata in gel che permette di rilevare gli anticorpi nella loro fase di secrezione in vitro quando essi ritrovano ancora attorno alle plasmacelulle che li hanno prodotti . In questa tecnica le cellule tratte da un tessuto linfoide periferico e immunizzate verso gli antigeni di una cellule (es. emazie di montone) vengono dissociate dal tessuto di origine e mescolate in agarosio fuso a 45° Celsius alle stesse emazie usate per causare l’immunizzazione primaria. Dopo poco la sospensione cellulare viene versata rapidamente su piastra di Petri e si lascia solidificare l’agarosio fino a raggiungere una temperatura di 37° la quale favorisce dopo qualche ora la comparsa degli anticorpi che diffondendo in modo radiale e fissandosi sulle cellule bersaglio causeranno la sintesi di “Placche di Emolisi” ben visibili sul manto di cellule eritrocitarie. L’aggiunta di complemento provoca la lisi localizzata visibile come un alone chiaro di circa mezzo millimetro (PFC Claque-Forming Cell). Il numero di PFC corrisponde al numero delle cellule che producono anticorpi in un dato organo. Questo numero aumenta rapidamente dopo l’immunizzazione e raggiunge valori massimi nel topo dopo quattro giorni dall’immunizzazione primaria. Si può facilmente dimostrare con tale tecnica che ogni cellule produce Ig di una sola specificità isotipica, allotipica e idiotipica. Possono essere utilizzati per l’immunizzazione anche antigeni solubili adsorbiti alla superficie delle emazie che svolgono il ruolo di segnalatori. Usando antigeni solubili si può inibire la comparsa di placche aggiungendo al sistema l’antigene non legato alle emazie. Si può in tal modo studiare l’avidità dell’anticorpo che è in rapporto inversamente proporzionale alla quantità di antigene necessario per inibire il 50% delle placche. Esistono numerose varianti della tecnica di Jerne, per esempio è possibile riempire con la miscela delle sottili camere dette “Camere di Cunningham” costituite da due vetrini portaoggetti sovrapposti e saldati ai lati con paraffina. La tecnica di JHerne classica è detta diretta perché mette in evidenza le cellule che sintetizzano IgM la quale è la classe di anticorpi dotata di più alta efficienza emolitica. Tuttavia tramite la Tecnica di Jerne “Indiretta” si possono evidenziare anche le cellule che producono le altre classi di immunoglobuline dotate di più bassa efficienza emolitica e che formano placche di emolisi solo indirettamente dopo l’aggiunta in vitro di anticorpi anti-immunoglobulina : si ottiene cosi l’effetto di aumentare il numero di molecole anticorpali che si legano a ciascun sito dell’emazia, perché per esempio aggiungendo anticorpi anti-Ig di coniglio si creano degli immunocomplessi che favoriscono l’instaurarsi della citolisi.
18) ROSETTAZIONE E, ME, EA, EAC: una rosetta è un linfocita alla cui superficie abbiano aderito almeno 3 emazie. Le tecniche di rosettazione sono state fra le prime utilizzate al fine di ottenere la valutazione di singole popolazioni o sottopopolazioni leucocitarie in un campione biologico. I linfociti possono aderire direttamente alle emazie di montone (Rosette E), oppure direttamente alle emazie di topo (Rosette ME), oppure possono aderire dopo produzione di anticorpi diretti contro le emazie eterologhe (Rosette EA) e infine possono aderire tramite anticorpi e complemento (Rosette EAC).
La rosettazione si verifica mettendo a stretto contatto i linfociti con le emazie mediante centrifugazione e dopo un opportuno periodo di incubazione.
La rosetta E si forma poichè sulle emazie di monte vi è la presenza di un ligando, l’LFA-3 che si lega al recettore CD2 dei linfociti T e B. Questa tecnica era usata un tempo per individuare i linfociti T, tuttavia si osservò come in tal modo venivano isolate anche le cellule NK che presentano anch’esse il CD2.
La rosetta ME si forma perché sull’eritrocita di topo c’è un ligando che viene riconosciuto da un recettore posto sulla membrana dei linfociti B. Un tempo veniva usata per individuare appunto i linfociti B dal resto delle cellule, tuttavia si osservò come soltanto i 2/3 circa degli elementi cellulari venivano effettivamente legati.
La rosetta EA e EAC possono essere usate per studiare i recettori di membrana per le immunoglobuline (Fc) e i recettori di membrana per i componenti del complemento (CR1, CR2, CR3, CR4). Sensibilizzando emazie di bue con dosi subagglutinanti di IgG anti-emazie di bue, si ottengono rosette EA per un legame del complesso emazia-IgG al recettore dei linfociti per il frammento Fc delle IgG. Tale recettore è localizzato su cellule quali i linfociti T suppressor, i linfociti B e i linfociti NK, oltre che neutrofili e monociti/macrofagi. Usando invece anticorpi IgM anti-emazie di bue per sensibilizzare le emazie si possono mettere in evidenza i recettori Fc per le IgM che sono possedute da una sottopopolazione di linfociti T helper e dai linfociti B. I recettori per frazioni del complemento vengono messe in evidenza con le rosette EAC e si osserva come i linfociti B possono essere studiati per la presenza nella loro membrana dei recettori CR1 e CR2, mentre il recettore CR3 è presente in una sottopopolazione di linfociti T e sulle cellule NK, oltre che sui neutrofili e sui monociti/macrofagi.
19) TECNICA DI IMMUNIZZAZIONE IN VITRO DI MICHELL-DUTTON PER LINFOCITI B: tecnica messa a punto alla fine degli anni ’60 e che permette di studiare più fedelmente la risposta dei linfociti B ad un antigene e la loro attivazione. La tecnica si basa sull’immunizzazione primaria in vitro con emazie di montone di colture di cellule spleniche murine dissociate dal tessuto di origine e mantenute in coltura in alta densità e in opportune condizioni sperimentali. L’anticorpopoiesi è valutata con questo sistema sperimentale tramite la tecnica delle placche di Jerne e raggiunge i valori massimi dopo 4-5 giorni dall’aggiunta dell’antigene. Con tale tecnica si è osservato per esempio che per una risposta immunitaria primaria è necessario che nella coltura vi sia anche la presenza di linfociti T cooperanti Helper e di cellule presentanti l’antigene quali i macrofagi. Con tale metodo è stato possibile anche attuare uno studio relativo all’attività immunomodulante di certi farmaci o di certi ormoni.
20) TECNICA DI IMMUNIZZAZIONE IN VITRO DI LINFOCITI B UMANI DI MISITI-HOFFMANN-WALDMAN: è una tecnica che si rifà sostanzialmente alla tecnica di Michell e Datton, tuttavia in questo caso vengono utilizzati linfociti prelevati dal sangue umano periferico e viene indotta una risposta immunitaria contro le emazie di montone ottenendo una anticorpopoiesi che raggiunge i valori massimi dopo circa 7 giorni.
21) TECNICA DI HOFFMAN CON MODULAZIONE DEI LINFOCITI T TRAMITE CONCANAVALINA A: è una tecnica che si rifà sostanzialmente alla tecnica di Michell e Dutton, laddove tuttavia è possibile studiare aspecificatamente la risposta immunitaria espressa grazie all’uso di sostanze mitogeniche. Ad esempio, Hoffmann ha osservato che mediante l’uso di Concanavalina A a dosi ridotte (submitogeniche) era possibile osservare una attivazione soprattutto dei linfociti T Helper, mentre utilizzando lo stesso mitogeno a dosi elevate (sopramitogeniche) si osservava una risposta che attivava soprattutto linfociti T soppressori.
22) REAZIONE LEUCOCITARIA MISTA: più che una tecnica, in tal caso parliamo di un fenomeno che si verifica fra leucociti isto-incompatibili appartenenti a due diversi soggetti e che vengono mescolati in vitro. In tal caso si osserverà una vera “guerra civile” con i linfociti dell’uno che agiranno contro gli altri e viceversa, a causa della presenza di antigeni transmembranari (soprattutto le molecole MHC di classe 2) che risultano essere reciprocamente immunogeni. Al fine di ottenere una reazione che consenta una valutazione corretta dell’attivazione dei linfociti T, è possibile utilizzare una MLR unidirezionale, cioè si procede a inattivare una delle due popolazioni in studio tramite l’uso di irradiazione o mediante Mitomicina C che blocca la proliferazione. Quindi in questo caso si avrà una popolazione “stimulator” e una popolazione “responder”. La tecnica MLR viene utilizzata per attuare una tipizzazione tissutale cioè per definire la specificità HLA delle cellule di un tessuto e di conseguenza la istocompatibilità. E’ opportuno specificare che in determinate condizioni è possibile evocare persino una MLR autologa, se per esempio vengono fatt proliferare linfociti T in vitro con linfociti B e monociti autologhi.
23) TECNICA DI TIPIZZAZIONE TISSUTALE: è una tecnica che viene attuata utilizzando linfociti di specificità nota, irradiati o tratati con mitomicina, e provenienti da soggetti che hanno ereditato lo stesso allele da ciascun genitore, cioè allo stato omozigote. Essi saranno riconosciuti in coltura dai linfociti T che non possiedono quell’allele (e vale anche per le cellule responder in eterozigosi per quell’allele) e vanno quindi incontro ad attivazione. La tipizzazione per antigeni HLA-DP viene eseguita generalmente a mezzo di colture miste secondarie (PLT) che utilizzano come cellule responder linfociti con identica combinazione di antigeni DR e DQ e già stimolati nel corso di una reazione primaria da un antigene DP incompatibile.
24) TECNICA DI REAZIONE CITOTOSSICA IN VITRO: praticamente è analoga alla tecnica basata sul fenomeno MLR con la differenza che in questo caso si sviluppa una reazione di citotossicità mediata dai linfociti T CD8 che riconosceranno come immunogeni soprattutto gli alleli del complesso HLA-A, B, C. Si valuterà l’effetto citotossico tramite l’uso di Cromo 51 (che viene aggiunto al sistema sottoforma di sale e che penetra all’interno delle cellule) che viene rilasciato dalle cellule in caso di lisi cellulare, si confronta quindi la quantità effettivamente rilasciata dallo scatenarsi della reazione immunitaria citotossica rispetto alla massima quantità potenzialmente riscontrabile.
25) TECNICA DI PRECIPITAZIONE FRAZIONATA: con questo termine ci si riferisce ad un insieme di tecniche che venivano usate in passato per ottenere dei precipitati da cui ricavare le molecole anticorpali. Le proteine possono essere fatte precipitare se trattate con acidi forti, con Sali di metalli pesanti, con solventi disidratanti come gli alcoli o l’acetone. La precipitazione frazionata con Sali sfrutta la diversa solubilità delle proteine in funzione della forza ionica delle soluzione. I Sali più usati sono i solfati di ammonio, di sodio e di zinco. Mettendo in contatto una miscela di proteine con determinate concentrazioni di questi Sali e operando a basse temperature per evitare processi di denaturazione si ottiene la precipitazione di alcune proteine e non di altre. Le proteine precipitate possono esser quindi ottenute mediante centrifugazione e successiva dialisi volta a eliminare i Sali impiegati. Ad esempio le globuline del siero possono essere separate dall’albumina mediante trattamento con ammonio solfato al 50% di saturazione: le globuline precipitano mentre l’albumina resta in soluzione. Un tempo si usava anche attuare una precipitazione delle proteine con soluzioni alcoliche quale ad esempio etanolo ma si tratta di un metodo molto grossolano anche se in passato molto usato.
26) TECNICA DI CROMATOGRAFIA: con il termine cromatografia si indica un gruppo di procedure di separazione che hanno in comune la ridistribuzione delle molecole di una miscela tra una fase stazionaria e una fase mobile che attraversa la fase stazionaria, la quale determina un rallentamento delle molecole presenti nella soluzione mobile consentendone la separazione. La fase stazionaria può essere una resina o dei gel di cellulosa che vengono poste dentro una colonna e che vengono attraversate da una soluzione detta “Eluente”, la quale viene analizzata da un fotometro a lettura continua che consente di valutare l’assorbanza a 280 nanometri (banda del triptofano) dell’eluato ottenendo cosi un parametro di valutazione della concentrazione proteica nell’eluato. Il dispositivo prevede anche un collettore di frazioni automatico e programmabile che permette di porre in recipienti separati le diverse frazioni proteiche presenti nell’eluato mentre queste scendono eluite dalla colonna. Le tecniche di cromatografia vengono attualmente usate per il dosaggio di Ig che siano polivalenti e multimeriche quindi a elevato peso molecolare, quali ad esempio le IgM o le IgA.
La cromatografia “a scambio ionico” si basa sull’impiego di sostanze chiamate “anfotere” che determinano un legame reversibile di tipo ionico con le molecole presentanti delle cariche elettriche. Variando la forza ionica e il pH di una soluzione tampone che attraversa nuovamente l’eluato si ottiene una eluzione delle frazioni molecolari.
La cromatografia “con gel di destrano-sephadex” le molecole vengono separate in base alle differenti dimensioni grazie a una fase stazionaria determinata da un reticolato di molecole destrano (“Sephadex” è il nome commerciale) che crea una porosità molto elevata.
La cromatografia “per affinità” è un’altra variante che prevede l’uso di un gel quale il “Sefarosio” che sia legato a delle molecole in grado di catturare alcune sottoclassi di molecole anticorpali, ad esempio alle molecole di sefarosio vengono legate le proteine A di stafilococco che in tal modo permettono di intercettare le IgG di classe 1, 2 e 4, tralasciando tutte le altre. La proteina A si lega al sefarosio solo se trattata con un agente quale il bromuro di cianogeno (CNBr2) il quale è un potente attivatore.
27) ULTRACENTRIFUGAZIONE: tecnica che consente una separazione delle particelle basandosi sulla massa e sulla differente velocità di precipitazione qualora sottoposte a ultracentrifuga a 50000 G e successiva precipitazione in soluzione di saccarosio che crea un gradiente di galleggiamento. La velocità è espressa in Svedberg.
28) NEFELOMETRIA LASER: tecnica che prevede una analisi tramite laser di una soluzione nella quale si crea una certa “torbidità”, cioè perde trasparenza, a causa della formazione di immunocomplessi. La trasformazione di un liquido da trasparente a torbido a causa della sintesi di immunocomplessi prende il nome di “Fenomeno di Tyndhall”. Il laser analizza una radiazione luminosa a lunghezza d’onda prestabilita e sincronizzata. Con questa tecnica è possibile analizzare immunocomplessi formati da tutte le classi anticorpali eccetto le IgE che non sono dosabili con tale tecnica. Brevità di esecuzione e alta precisione rendono questa una delle tecniche migliori.
29) IMMUNOBLOTTING O WESTERN BLOT: è una tecnica che consente di identificare particolari antigeni in una miscela di proteine che sono state separate fra loro con metodi fisici e trasferite su una membrana in genere di nitrocellulosa. Il metodo viene impiegato per la diagnostica delle infezioni da Hiv e per numerose altre applicazioni. La procedura prevede la separazione elettroforetica della particelle tramite una elettroforesi in gel di poliacrilammide e previo uso di sodio dodecil solfato per neutralizzare i punti isoelettrici, quindi si attua un trasferimento delle molecole su fogli di nitrocellulosa dove costituiscono delle macchie (blotting), tali fogli sono suddivisi in strisce larghe circa 3 millimetri e su ciascuna striscia vengono posti gli anticorpi che costituiscono immunocomplessi con i relativi antigeni da studiare. Le strisce sono quindi lavate con soluzioni tamponate al fine di allontanare le proteine non legate in immunocomplessi e vengono quindi trattate con anticorpi anti-immunoglobline marcati con perossidasi. Si sviluppa quindi una reazione per la perossidasi. Si nota una banda colorata in corrispondenza di ciascuna frazione proteica con la quale hanno reagito gli anticorpi. L’immunoblotting viene impiegato per discriminare eventuali anticorpi diretti contro contaminanti cellulari delle preparazioni di virus impiegati nella diagnostica di screening e di identificare i diversi antigeni virali contro cui si ha una risposta anticorpale.
30) TECNICA DEL SOUTHERN BLOT: è una tecnica inventata da Southern negli anni ’70 ed è stata utilizzata con successo per la studiare la sequenza di numerosi frammenti di DNA e ottenere informazioni relative alla posizione e alla struttura dei geni. Si può dire che costituisce uno dei successi che ha aperto la strada all’avvento della biologia molecolare e allo studio del genoma umano. La tecnica è composta da più passaggi. Il DNA del quale si intende individuare e analizzare un determinato gene viene trattato con uno o più enzimi di enzimi di restrizione, la miscela di frammenti ottenuta viene applicata su di un gel (per esempio su di un manto di agarosio) in modo che i frammenti si separino tra loro in base alle loro dimensioni. I frammenti di DNA separati sono poco utilizzabili perché il gel è fragile e poco maneggevole. Si trasferisce il DNA dal gel su di un foglietto di una membrana di nitrocellulosa o di nylon. Questo processo di trasferimento (che costituisce il Southern blot in senso stretto) sfrutta la capillarità della soluzione tampone che attua un flusso dalla bacinella verso gli strati di nitrocellulosa, trascinando con se i frammenti di DNA dal gel stesso sulla membrana e legandosi a questa. E’ da notare che le posizioni reciproche dei frammenti (determinate nel gel dalle dimensioni di ciascun frammento) rimangono le stesse dopo il trasferimento sulla membrana rispetto al gel. Una volta ottenuto il trasferimento, si ottiene un frammento di Dna complementare al gene o a parte del gene che intendiamo individuare e analizzare, tale frammento viene manipolato con tecniche opportune (quale la più popolare prende il nome di “nick traslation”) e che consentono di introdurre nella struttura del Dna delle molecole di fosforo radioattivo. Il frammento marcato di DNA è denominato sonda. A questo punto si attua una reazione di ibridizzazione tra frammenti di Dna trasferiti sulla membrana e la nostra sonda radioattiva, tra i tanti frammenti la sonda marcata si “ibridizzerà” solo con il frammenti o i frammenti a lui complementari. Dopo aver rimosso l’eccesso di sonda con opportuni lavaggi sulla membrana rimane legata solo la sonda specificatamente ibridizzata al nostro gene. Basta mettere le membrane a contatto con una lastra per autoradiografia che verrà impressionata dall’emissione di particelle radioattive della sonda dando quella che viene detta banda di ibridizzazione e in questa maniere possiamo sapere se il DNA esaminato ha quel determinato gene, oltre che il numero e le dimensioni dei frammenti generati in quel gene dal trattamento con un determinato enzima di restrizione.
31) TECNICA DEL NORTHERN BLOT: analoga alla Southern, sfrutta gli stessi principi e ha la caratteristica di essere applicata per lo studio delle sequenze RNA. Vale la pena ricordare che non esiste alcun dottor Northern, ma il termine è stato coniato per sottolineare il semplice contrasto fra le due tecniche. Anche per il Northern l’acido nucleico viene separato dall’RNA cellulare e purificato mediante frazionamento in gel con elettroforesi, la purificazione richiede precauzioni data la presenza ubiquitaria di RNAsi che degradano rapidamente le sequenze. Sono state quindi sviluppate metodiche più rapide in cui il lisato cellulare viene legato direttamente, senza impiego di elettroforesi, a una membrana di nitrocellulosa o nylon per poi essere ibridizzato con una sonda di interesse (metodo DOT o SLOT BLOT).
32) IBRIDAZIONE IN SITU: tale tecnica consente di identificare la presenza di un dato mRNA in cellule singole mantenendo l’integrità della cellule o dei tessuti Si utilizzano sonde di DNA o RNA complementari all’mRNA che si intende studiare marcate con un radioisotopo, la sonda viene fatta interagire con la sezione istologica del tessuto o con la preparazione cellulare su vetrino, dopo lavaggi appropriati gli eventuali trascritti presenti verranno identificati mediante autoradiografia.
